基于新版本农业行业标准的水稻品种真实性SSR检测方法

杨华　李亚春　毛从亚

摘要：新的农业行业标准NY/T 1433—2014《水稻品种鉴定技术规程：SSR标记法》于2014年6月1日实施，笔者所在实验室依据新的标准建立了新的水稻品种真实性鉴定体系。将2个水稻样品（编号为A、B）与其标注的品种名称相同的标准样品（编号：SD20140244）进行了比对，结果表明，样品A与标准样品无位点差异，判定为近似品种；样品B与标准样品有6个位点差异，判定为不同品种。

关键词：水稻；行业标准；品种真实性鉴定

中图分类号： S511.037 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0087-03

水稻品种真实性鉴定即鉴定一份种子样品与所属的品种、种或文件描述是否相符。最初一般采取田间种植鉴定的方法对品种真实性进行鉴定，但是由于此方法周期长，有时鉴定结果出来后种子销售已经结束，不能满足种子市场管理机构快速、准确鉴定种子真实性的新要求。另外由于江苏省以常规水稻为主，部分品种亲缘关系比较近，田间种植表型差异很小，甚至基本无表型差异，给鉴定工作造成了困扰。随着生物技术的飞速发展，分子标记技术尤其是SSR分子标记技术在品种真实性鉴定工作中被广泛应用[1-4]。SSR分子标记具有非组织和发育阶段特异性、不容易受外界环境影响、多态性高、在基因组中分布广泛、呈共线性遗传等优点[5-7]。采用SSR分子标记技术检测品种真实性的方法快速、简便且重演性高。2007年，国家出台了农业行业标准NY/T 1433—2007《水稻品种鉴定：DNA指纹方法》，一直以来，种子检测机构进行水稻品种真实性鉴定工作时都是以此标准作为检测和结果判定的依据。2014年，农业部在深入研究和广泛征求基层单位意见的基础上更新了此标准，出台了新的农业行业标准NY/T 1433—2014 《水稻品种鉴定技术规程：SSR标记法 》。本检验室依据新的技术标准建立起新的水稻品种真实性鉴定体系，并进行了大量的检验工作对新体系进行验证。本研究以2个水稻样品（编号为A、B）与其标注的品种名称相同的标准样品（编号：SD20140244）比对为例，说明此方法的可操作性和适用性。

1 材料与方法

1.1 标准样品

选取保存在江苏省农作物种子质量检验中心标准样品库中编号为SD20140244的标准样品。

1.2 待测样品

2个待测样品分别来自市场抽检中标签标注与编号为SD20140244的标准样品品种名称相同的样品，编号为A、B。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 本试验采用水稻干种子直接提取方法，样品经SPEX Geno 2010 高通量冷冻研磨机磨碎后，用Omega公司的植物基因组DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.TM Plant DNA Kit D3485-01）提取水稻全基因组DNA，详细方法见试剂盒说明书。用微量紫外分光光度计（Thermo Scientific ND2000）检测DNA质量浓度，并稀释到50 ng/μL备用。

1.3.2 PCR扩增 采用NY/T 1433—2014《水稻品种鉴定技术规程：SSR标记法》标准中规定的48对引物进行PCR扩增。采用北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 PER001-2型号Taq酶混合物作为反应体系。反应程序为：94 ℃下预变性2 min；进行35次扩增反应循环（94 ℃下变性45 s，58 ℃下退火45 s，72 ℃下延伸1 min）；72 ℃下延伸8 min；10 ℃恒温冷却。

1.3.3 电泳及染色 采用NY/T 1433—2014《水稻品种鉴定技术规程：SSR标记法》中规定的非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳和染色方法。染色结束后用Bio-RAD公司的Gel Dox XR+型号凝胶成像系统进行扫描成像，并用Image lab 4.1软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 DNA提取

鉴于之前标准中需要先发芽再提取DNA的周期太长，近1周时间，本研究直接采用干种子磨碎DNA提取试剂盒的方法进行提取，每个样品只需1.5 h就能提取到水稻全基因组DNA，提取的DNA经过检测质量较高（表1），完全符合PCR扩增的需要，极大提高了检测效率。

2.2 PCR反应优化

新标准中规定的48对引物最适合的退火温度不同，为50～67 ℃，为最大限度地将标准样品和待测样品放于同一PCR板中进行检测，经过不同温度试验，选取58 ℃为退火温度，在此温度下48对引物均能得到特异性比较好的目的条带（图1、图2）。

2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析

依据新标准中的电泳方法、染色方法，2组比对试验均得到了较为清楚的指纹图谱。清晰的指纹图谱是分析、判定结果的重要前提，不同的实验室应根据自己的情况选择合适的药品和设备进行试验，以得到特异性条带清楚、背景干净的图谱，才能进行接下来的数据分析。指纹图谱经凝胶成像系统成像后，导入分析软件进行分析，分别标记泳道和条带，计算条带大小。按照新标准中的数据记录方式记录条带信息。纯合位点的基因型数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的基因型数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上2个不同等位变异。小片段在前，大片段在后。缺失位点记录为0/0。此种记录方法的优点是不仅能够反映待测样品与标准样品的差异，还能反映位点的基因型及变异的大小，将数据记录的结果统一，也便于后期指纹图谱数据库构建和不同实验室之间标准样品信息的共享（表2）。

2.4 SSR标记法鉴定水稻品种真实性结果判定

新标准对于结果判定也进行了规定，当样品间差异位 点≥2，则判定为“不同品种”；当样品间差异位点=1，则判定为“近似品种”；当样品间差异位点=0，则判定为“极近似品种或相同品种”。从表2可以看出，样品A与标准样品之间无差异位点，即差异位点=1，所以判定样品A与标准样品为相同品种；样品B与标准样品在引物（B02、B06、B11、C02、C09、C11）扩增出的基因位点上存在差异，即样品间差异位点为6，判定样品B与标准样品为“不同品种”。

3 结论与讨论

江苏省是种业大省，同时也是中国水稻主产省和高产省之一，素有“鱼米之乡”之称，从事农作物品种选育的科研单位40余家，目前为止通过江苏省审定的水稻品种有213个，通过国家审定的有78个，品种众多[8]。正是因为品种多、品种杂以及从事水稻生产销售的主体多，使得种子市场上制售假劣种子、套牌侵权、未审先推等问题屡屡出现，在社会上引起了广泛关注，严重损害了农民和品种权人权益，阻碍了现代种业可持续发展。这就要求从事相关种子检测工作的检验中心具备有据可依、快速、准确的品种真实性鉴定手段。2014年实施的农业行业新标准在试验方法、数据记录与统计、结果判定等方面都进行了优化和改进，并且将原来的24对引物保留了19对，新增了29对引物，最终确定了48对引物；此外还增加了变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳荧光检测等新的检测平台。新标准的实施为水稻品种真实性鉴定室内分子检测方法提供了判定依据，新标准检测体系也能为农业行政执法部门开展执法工作以及种子市场监管工作提供相应的技术支撑，减少假劣种子进入市场的概率，促进江苏省种业健康、有序、可持续发展。

参考文献：

[1] 王 飞. SSR分子标记在棉种真实性和纯度中的应用研究[D]. 北京：中国农业科学院，2013.

[2]王凤格，赵久然，戴景瑞，等. 利用SSR标记进行玉米品种一致性检测研究[J]. 分子植物育种，2007，5（1）：95-104.

[3]周 会，苏 秀，毛双林，等. 杂交水稻品种真实性和纯度的SSR分子标记鉴定[J]. 种子世界，2014（3）：34-35.

[4]张冰清，陆徐忠，吴新杰，等. 利用SSR标记进行杂交油菜品种鉴定[J]. 中国油料作物学报，2014，36（6）：728-734.

[5]罗 冉，吴委林，张 旸，等. SSR分子标记在作物遗传育种中的应用[J]. 基因组学与应用生物学，2010，29（1）：137-143.

[6]罗 兵，孙海燕，徐港明，等. SSR分子标记研究进展[J]. 安徽农业科学，2013，41（12）：5210-5212，5246.

[7]杨文柱，焦 燕.SSR分子标记技术在生物遗传学领域的应用[J]. 安徽农业科学，2012，40（2）：640-642.

[8]殷钱茜，殷海军.江苏水稻种子产业现状、问题及发展对策[J]. 山西农业科学，2013，41（5）：515-519.