怀牛膝组织培养和快速繁殖体系的优化

刘颖　李冬杰　王沛沛

摘要：为优化怀牛膝（Achyranthes bidentata BL.）组织培养和快速繁殖体系，以怀牛膝茎段作为外植体，选择MS为基本培养基，研究不同激素配比对组培快繁的影响。结果表明，3种激素对于外植体芽诱导中影响顺序依次为6-BA>IBA>KT，最佳芽诱导优化培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT。诱导丛生芽增殖的培养基以MS+1.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT为最优，增殖系数达6.03。优化生根培养以1/2 MS+0.5 mg/L IBA效果最佳，生根率最高，达95.1%。组培苗移栽至炭灰 ∶ 营养土 ∶ 蛭石（体积比1 ∶ 2 ∶ 1）的基质中，成活率达到100%，且植株生长健壮。

关键词：怀牛膝；组织培养；快速繁殖；优化

中图分类号： Q945.5；S567.23+9.043 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0083-04

怀牛膝（Achyranthes bidentata BL.）属苋科牛膝属多年生草本植物，高70～120 cm，生长于河南沁阳、武陟、修武、温县一带，为中国著名的“四大怀药”之一[1]。其根呈圆柱形，直径5～10 mm，土黄色；茎有棱角或四方形，绿色，有的还带有紫色；叶片一般是椭圆形或是椭圆披针形，基部呈楔形或是宽楔形。怀牛膝因其根含皂苷元、齐墩果酸、蜕皮激素、牛膝多糖等有效成分，具有补肝肾、强筋骨、通血脉、降血压、镇痛、引药下行和泻浊通淋等功效[2]，所以越来越受到人们的青睐，具有广阔的开发利用前景。为了满足市场需求，须要对其进行大规模的培养栽培。近年来，对于牛膝的组织培养研究也有相关报道[3-5]，但对于外植体选择、激素配比及丛生芽分化上还存在一些问题[6-7]。本研究选取怀牛膝茎段为外植体，建立并优化怀牛膝的组织培养及快繁体系，以期获得最佳的组培条件，整体提高怀牛膝组培的效率，为其药用成分的长期工厂化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料由河北科技大学植物组织培养实验室提供，以含有1～2个芽眼的怀牛膝2 cm幼嫩茎段为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体处理 选取怀牛膝2 cm带腋芽茎段，先用去离子水冲洗，再加入稀释的洗洁精清洗，之后置于超净工作台上。用75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗3次，然后用0.1%氯化汞消毒3 min，最后用无菌水冲洗3次，用消毒滤纸吸干水分，在无菌条件下，把消毒后的茎段切成0.5 cm 的小段待接种。

1.2.2 芽诱导培养基的优化 以MS为基本培养基（蔗糖3%、琼脂0.8%，pH值为5.7～5.8），添加不同浓度的6-BA、IBA、KT，采用L9（34）正交设计表（表1），以筛选出最佳的激素组合，确定最佳的诱导培养基。将消毒处理后的外植体置于诱导培养基上，每种培养基中接种3个，重复3次，置于培养室中，进行培养并定期观察不同外植体的诱导及分化情况，14 d后统计每个外植体诱导出的丛生芽数。

1.2.3 丛生芽增殖培养基的优化 以MS为基本培养基（蔗糖3%、琼脂0.8%，pH值为5.7～5.8），添加IBA 0.5 mg/L、KT 0.2 mg/L及3种不同浓度梯度的6-BA（表2），以筛选出最佳的6-BA浓度，确定最优的增殖培养基。切取1 cm长的单芽接种至3种增殖培养基上，每种培养基接种30个，置于培养室中进行增殖培养，观察丛生芽增殖及生长情况，25 d后统计丛生芽的增殖系数（增殖系数=丛生芽分化的个数/丛生芽分化的外植体数）。

1.2.4 生根培养基的优化 切取生长较粗壮的丛生芽接种于1/2 MS培养基 （蔗糖3%、琼脂0.8%，pH值5.7～5.8） 上，并添加不同浓度的激素 （表3）进行生根诱导培养，每种培养基接种约30个丛生芽。观察根的萌发及生长情况，统计根长、生根数和生根率（生根率=生根的组培苗数/接种的组培苗数×100%）。

1.2.5 培养条件 培养室的温度为（25±2） ℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为14 h/d。

1.2.6 练苗与移栽的优化 当生根苗长至5 cm时，置于温室中揭去瓶盖练苗4 d。然后用镊子取出小植株，流水洗净根部附着的培养基，移栽至苗床上，苗床基质采用4种处理，分别为（1）草炭土；（2）营养土；（3）草炭土+营养土+蛭石（体积比1 ∶ 2 ∶ 1）；（4）营养土+蛭石（体积比2 ∶ 1）。将移栽苗置于相对湿度80%～90%、温度（25±2） ℃的环境中遮阴培养。培养期间，用1/2 MS的大量元素的营养液润湿基质，观察怀牛膝苗的生长情况，30 d后统计成活率，并比较生长状态。

1.3 数据统计

利用SPSS 20.0软件统计分析数据。

2 结果与分析

2.1 外植体芽诱导的优化

将处理后的怀牛膝带芽茎段分别接种于不同激素浓度组合的诱导培养基中，在相同条件下进行离体培养，比较不同激素浓度配比对外植体芽诱导的影响，正交试验结果见表4，方差分析结果见表5。

从表4可以看出，试验中选取的3种激素，即6-BA、IBA、KT对怀牛膝外植体的诱导均具有影响。通过极差分析得出，3种激素对于丛生芽诱导的影响从强到弱依次为 6-BA>IBA>KT，3种激素最优水平的组合是A2B1C2。方差分析结果表明，3种影响因素的不同水平之间均存在极显著差异，3种激素的不同浓度配比对外植体的诱导具有极显著的影响。

在9种不同浓度的激素组合培养基中外植体芽的诱导和生长情况不同（表4、图1）。接种在4号培养基中的外植体出芽数最高，平均达到3.25；4号培养基中外植体芽的生长状态最好。培养7 d后，9种培养基中的外植体均于切口处萌发侧芽，使其出现了启动现象。但随着培养时间的延长，不同培养基中的外植体芽生长情况出现了差异。5号、6号培养基中茎段基部愈伤组织生长旺盛，丛生芽数量少，而4号培养基中茎段的腋芽着生处膨大变绿，在切口处形成少量的绿色愈伤组织；并在茎节或茎尖端紧靠茎节上、下的部位分化出侧芽，且生长旺盛；14 d形成丛生芽。

结合正交试验分析结果及外植体芽诱导和生长情况，4号培养基的激素浓度配比为1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT，为怀牛膝外植体芽诱导的最佳激素配比方案。

2.2 丛生芽增殖的优化

正交试验结果表明，影响怀牛膝丛生芽诱导分化的主要因素是6-BA，试验设计了6-BA 3个不同浓度梯度的增殖培养基。将怀牛膝单芽接种至3种不同的增殖培养基中，观察丛生芽的增殖及生长情况，培养30 d后统计丛生芽的增殖

系数及株高，比较不同6-BA浓度对丛生芽增殖的影响（表6）。结果表明，在Z2培养基中，即添加1.3 mg/L 6-BA时，丛生芽的增殖系数最高，平均为6.03，丛生芽生长最快，且植株总体生长状况最佳，整体表现均匀、壮实，植株株高达4.12 cm（图2）。培养基6-BA浓度增加1.5 mg/L或浓度减少至1.0 mg/L，丛生芽增殖系数和株高均偏低，且3种不同浓度的6-BA诱导丛生芽增殖的效果差异显著。牛膝丛生芽增殖最适的6-BA浓度为1.3 mg/L，最优的增殖培养基为Z2，即MS+1.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT。

2.3 诱导生根的优化

选取生长健壮且长势一致、高3～5 cm的丛生芽接入4种不同生根培养基中进行生根诱导。7 d可见根已长出，11 d根长可达约5 cm，根数最多达到8条，单芽长高变大，逐渐长成苗。从表7可以看出，在1/2 MS培养基中添加一定浓度的NAA或IBA都可以诱导怀牛膝丛生芽生根，但不同激素种类和浓度对生根诱导的影响不同（图3）。多重比较分析结果显示，4种不同生根培养基中丛生芽的根长、平均生根数、生根率均存在显著差异。整体来看，在添加NAA的G1、G2培养基中，怀牛膝丛生芽生根速度慢，根粗且短，生根率低；而在添加IBA的G3、G4培养基中，丛生芽生根速度较快，生根率较高。在G4培养基中生根效果最好，生根率最高，为95.1%，并且生根速度快，根多而长，粗细适中。所以，怀牛膝丛生芽诱导生根的最佳培养基为G4培养基，即1/2 MS+0.5 mg/L IBA。

2.4 组培苗练苗移栽的优化

怀牛膝生根苗经过练苗4 d后移栽至4种基质中，比较在不同的基质中组培苗的生长情况，结果（表8）表明，怀牛膝的生根苗移栽至草炭灰 ∶ 营养土 ∶ 蛭石（体积比1 ∶ 2 ∶ 1）的基质中成活率最高，达100%，且15 d后幼苗长出新叶（图4），植株壮实。

3 结论与讨论

植物生长调节物质对植物细胞的分裂、分化产生影响。一定浓度配比的细胞分裂素和生长素对丛生芽的诱导与增殖发挥着重要作用。不同激素浓度组合的正交试验及极差分析结果表明，3种激素对于丛生芽诱导的影响从强到弱依次为6-BA>IBA>KT，3种激素最优水平的组合是A2B1C2。以此激素组合的培养基诱导怀牛膝外植体出芽数最多，平均值达3.25，并且外植体芽生长健壮、长势好，综合正交试验结果和外植体芽的诱导分化，筛选出怀牛膝外植体芽诱导的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT。结果表明，细胞分裂素6-BA在丛生芽诱导中最为重要，它可以促进细胞分裂，使芽分化，促进萌发[8]，特别是与一定浓度的生长素协同作用时会加速细胞分裂，加快丛生芽分化生长的速度。增加6-BA浓度，外植体的出芽数会增加，但当6-BA浓度达到1.5 mg/L时，外植体的出芽数呈减少的趋势，外植体芽的诱导受到了抑制，本结论与刘坚等的研究结果[9]一致，可能与试验材料自身生理特性及细胞分裂素和生长素的交互作用有关[10]。在丛生芽增殖诱导中，设计6-BA的3个浓度梯度[11]，获得最佳的增殖培养基为MS+1.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT，增殖系数最高达6.03。

生根过程起始于茎内已分化潜伏的根原基，研究表明，生长素IBA和NAA对根的形成均发挥着重要作用。IBA可以促进根原基的产生，激活不定根[12]，加快不定根生长的速度，且形成的不定根细而长，在根与茎之间连接紧密，有利于组培苗大范围吸收营养及水分。而NAA作用机理主要是为根的形成提供能源和碳源。通过不同浓度IBA、NAA的对比试验发现，IBA在生根速度、生根条数及生根率上均优于NAA。生根培养以培养基1/2 MS+0.5 mg/L IBA效果最佳，生根率最高，达95.1%，且每株组培苗平均生根数约为8条。

栽培基质是组培苗移栽成活的基础，在保水性能好且通风透气的栽培基质中，组培苗成活率较高[13]。通过不同基质的配比试验得出练苗后置于草炭灰 ∶ 营养土 ∶ 蛭石（体积比1 ∶ 2 ∶ 1）的基质中，组培苗成活率可以达到100%，且植株生长健壮。

本研究从外植体芽诱导、丛生芽增殖、丛生芽生根、组培苗练苗移栽4个阶段优化怀牛膝组织培养和快速繁殖体系，整体提高组培效率，为实现怀牛膝工厂化快速繁育奠定基础。

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