利用ISSR分子标记分析辣椒种质资源遗传多样性

刘君　李东　曾林

摘要：运用ISSR标记对8种辣椒进行了遗传多样性的研究。用30条ISSR引物进行筛选，有21条可扩增出清晰可辨条带，而这21条引物在8种材料中共扩增出382个条带，其中270个条带（70.6%）表现出多态性；根据Nei和Li等的遗传相似系数（GS）和遗传距离（GD）对8种材料进行分析，结合SPSS 16.0分析软件进行聚类，构建其遗传相关聚类图谱。

关键词：辣椒；ISSR；分子标记；遗传多样性

中图分类号： S641.303.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0080-03

辣椒（Capsicum annuum）别名番椒，于明末清初传入我国，至今已有300多年的栽培历史[1]。我国辣椒种植面积有33万～40万hm2，主要分布为福建的小米椒、四川的朝天椒、江南的羊角椒、河南的樱椒、山东的大红椒等。作为在食品烹饪加工中不可缺少的佐料佳品，其味辛香，性温热，有刺激性，同时兼具很高的营养价值，是人们喜爱的蔬菜和调味品，每年产量和经济效益稳居蔬菜作物之首[2-3]。

在真核生物基因组中散步着大量的简单串联重复序列（simple sequence repeat，SSR）[4]。SSR通常为1～4个碱基组成的4～10个或者更多个串联重复单元。简单序列重复区间扩增多态性（inter-simple sequence repeat，ISSR）[5]是在SSR基础上发展起来的一种新的标记技术。其基本原理是在SSR序列的5′或3′端加1～4个锚定碱基，并以此为引物对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。ISSR 是一种快速、可靠的标记技术，具有更好的稳定性和重复性，在植物领域中已经广泛用于重要的农作物如水稻[6]、小麦[7]和棉花[8]等的品系鉴定、遗传作图、基因定位及遗传多样性分析等研究中。当前，ISSR标记亦存在一些缺点，限制了其在某些方面的应用，目前ISSR标记技术主要应用在植物方面，而在动物方面的应用鲜有报道。辣椒以其独特的蔬菜和调味品地位越来越受到人们的关注，本研究采用ISSR分子标记对不同来源的8个辣椒种子的遗传多样性进行了系统分析。

1 材料和方法

1.1 材料处理

1.1.1 材料 本试验8种辣椒材料及编号见表1。脱氧核苷三磷酸（dNTP，2.5 mmol/L）、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）；PCR引物序列见表2。

1.1.2 仪器与设备 PCR扩增仪：Eppendorf AG22331 Hamburg；电泳仪：nYY-12型电脑三恒多用电泳仪；凝胶成像系统：TANON-200。

1.1.3 材料处理 8种辣椒种子在实验室培养成幼苗，取其幼苗在-80 ℃的冰箱中冷冻24 h后，取出研磨成粉末后立即装入1.5 mL离心管中。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与检测 使用改良的CTAB法提取辣椒基因组DNA；采用琼脂糖凝胶电泳法检测辣椒DNA的完整性。

1.2.2 ISSR-PCR扩增体系 PCR反应在基因扩增仪中进行。PCR反应体系为25 μL，反应体系如表3。PCR扩增条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火（温度由引物决定）30 s，72 ℃ 60 s，40个循环；72 ℃ 10 min。

1.2.3 ISSR产物的检测 扩增产物在3%的琼脂糖凝胶中电泳，然后采用凝胶成像系统拍照保存。

1.2.4 数据分析 统计条带的有无，强带和可重复出现的弱带记为有，否则为无。采用Nei和Li等的计算法GS=2Nij/（Ni+Nj）和GD=-lnGS，来计算两两材料间的相似性系数（GS）和相似距离（GD），其中Nij为材料i和j共有的条带数，Ni和Nj分别为材料i和j各自的条带数。利用SPSS 16.0分析软件进行聚类，构建遗传相关聚类图谱。

2 结果与分析

2.1 辣椒DNA质量和完整性

通过改良的CTAB法提取8种辣椒幼苗的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，提取的DNA条带明亮完整，无拖尾现象。说明提取出的DNA中蛋白质和多糖的污染少，提取的基因组DNA质量可以满足ISSR分析的要求。

2.2 引物的扩增效果

如表4所示，30个ISSR引物对8个辣椒的多态性分析结果表明：除ISSR-01、ISSR-02、ISSR-03、ISSR-23、ISSR-25、ISSR-26、ISSR-27、ISSR-29外，有21个ISSR引物可获得稳定的多态性条带。21个引物共扩增出382个条带（图2），片段大小为250～2 000 bp，各个引物扩增的条带数为1～8个，多态性条带为270个，平均多态率为70.7%。

2.3 不同试验材料间的遗传相似系数

以引物ISSR-15为代表，说明不同材料之间的遗传相似系数。表5是引物ISSR-15的扩增条带数，表6是辣椒分子标记遗传多样性条带数。通过表5和表6可得出两两辣椒品种之间的遗传相似系数以及遗传距离。表7为两两辣椒品种之间的遗传相似系数比较。表8为两两辣椒间的遗传距离比较。

用引物ISSR-15进行扩增，得出8种材料在引物 ISSR-15中的扩增条带数为40条。而8种材料两两之间进行成对比较共得到29个GS值，并且两者之间的遗传相似系数变化范围为0.55～0.91，平均遗传相似系数为0.806，平均遗传距离为0.227。ISSR-15引物对2个辣椒品种间遗传相似系数之间的差异不大，利用两两品种遗传相似系数越大、品种亲缘关系越近的原理，8个辣椒品种间的遗传相似系数变化范围为0.55～0.91。

2.4 聚类分析

根据8个辣椒DNA在引物ISSR-15的遗传相似系数进行聚类，结果如图3所示。再根据表5可将8个辣椒品种分为3类：第1类为2011-4、新9A、细线，3个辣椒两两遗传相似系数为0.91，因此三者之间的亲缘关系最近；第2类为郭228、261A、色2011-2，亲缘关系较近；第3类为丰三A、万一，遗传相似系数为0.55，亲缘关系较远。

3 结论

利用ISSR分子标记分析辣椒种质资源遗传多样性研究，

用30条ISSR引物进行筛选，有21条可扩增出清晰可辨条带，而这21条引物在8种材料中共扩增出382个条带，其中270个条带（70.6%）表现出多态性；另外，以引物ISSR-15为例，分析8个辣椒品种间的亲缘关系，可将8个辣椒品种分为3类：第1类为2011-4、新9A、细线，3个辣椒两两遗传相似系数为0.91，三者之间的亲缘关系最近；第2类为郭228、261A、色2011-2，亲缘关系较近；第3类为丰三A、万一，遗传相似系数为0.55，亲缘关系较远。因此，根据Nei和Li等的遗传相似系数（GS）和遗传距离（GD）公式，再利用SPSS16.0分析软件进行聚类，构建了遗传相关聚类图谱，为辣椒抗病育种以及综合防治提供了重要的理论参考。ISSR标记技术以其多态性高、稳定性强、简便快捷等优势在未来必将在更多物种、更多领域中获得广泛的应用。

参考文献：

[1]王永平，张绍刚，张 婧，等. 我国辣椒产业发展现状及趋势[J]. 河北农业科学，2009，13（6）：135-138.

[2]毛亦卉，向拉蛟. 对我国辣椒产业发展对策思考[J]. 辣椒杂志，2007，5（3）：1-4.

[3]赵 宁. 从干红辣椒中提取辣椒红素的研究[D]. 北京：北京化工大学，2004：1-2.

[4]Kashi Y，King D，Soller M. Simple sequence repeats as a source of quantitative genetic variation[J]. Trends in Genetics，1997，13（2）：74-78.

[5]Godwin1 I D，Aitken E A B，Smith L W. Application of inter simple sequence repeat（ISSR） markers to plant genetics[J]. Electrophoresis，1997，18（9）：1524-1528.

[6]黄光文，陈觉梁，王伟成，等. 运用ISSR标记鉴别水稻品种的初步研究[J]. 杂交水稻，2006，21（3）：64-67.

[7]张立荣，刘大群，徐大庆，等. 小麦ISSR分析初探[J]. 河北农业大学学报，2004，27（1）：10-13.

[8]袁洪波，艾尼江，赵建军，等. 棉花黄萎病菌致病力分化与 ISSR 遗传变异分析[J]. 华北农学报，2013，28（5）：84-89.