多菌复合固态发酵富硒豆粕的工艺优化

邱丰艳 陈柳花 林标声 杨小燕

摘要：研究了移動袋装多菌复合固态发酵富硒豆粕的最佳生产工艺条件。选用地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌4种菌株，通过移动袋装固态发酵技术复合发酵富硒豆粕，利用响应面分析法对其发酵条件进行优化，并对产品进行品质检验。结果表明，豆粕富硒发酵的最优菌株配比为地衣芽孢杆菌∶酿酒酵母∶产朊假丝酵母∶嗜酸乳杆菌=2∶1∶2∶2；亚硒酸钠、豆粕、菌液接种量为影响发酵过程中重要的3个因素，其最佳配比为亚硒酸钠19.43 mg/kg、豆粕91.38%、菌液接种量11.62%，经验证试验，在该条件下有机硒转化率能达到55.48%；富硒豆粕发酵产品经检验，其直观评价、有机硒含量、营养成分、有害物质等指标均得到明显改善，符合国家《饲料添加剂安全使用规范》。豆粕经多菌株联合富硒发酵，其产品性能得到明显改善，是一种优质的富硒菌制剂和功能性蛋白饲料。

关键词：固态发酵；复合菌；富硒；豆粕；响应面分析法

中图分类号：S816.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）05-1247-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.040

Optimization of the Solid-state Fermentation of Soybean Pulp Enriching

Selenium by Compound Bacteria

QIU Feng-yan1，CHEN Liu-hua1，LIN Biao-sheng1，2，YANG Xiao-yan1，2

（1.College of Life Science，Longyan University，Longyan 364012，Fujian，China；

2.Key Laboratory of Fujian Universities Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology， Longyan 364012， Fujian，China）

Abstract： The optimum process conditions of soybean pulp enriching selenium solid-state fermentation by compound bacteria in the mobile bag were studied， the four strains Bacillus licheniformi， Saccharomyces cerevisiae， Candida utilis， Lactobacillus acidophilus were used in soybean meals enriching selenium fermentation by moving solid-state fermentation technology， and the response surface method was used to optimize the fermentation conditions， then the product quality was inspected. The results revealed that the optimal conditions of soybean pulp enriching selenium fermentation were as flows： the ratio of Bacillus licheniformi， Saccharomyces cerevisiae， Candida utilis to Lactobacillus acidophilus was 2∶1∶2∶2. Sodium selenite， soybean pulp and inoculum size were the three main factors in fermentation， its proportioning were 19.43 mg/kg，91.38%，11.62%， respectively. On the optimized conditions， the convert ratio of organic selenium transformation can achieve to 55.48%. The product quality of soybean meals enriching selenium fermentation was inspected， its visual evaluation， the content of organic selenium， nutrition， and other harmful substances indicators had improved significantly， comply with the national standard “Specification for the safe use of feed additives”. Overall， through compound bacteria enriching selenium fermentation， the product performance of soybean pulp had improved significantly， it was good bacteria preparation and functional protein feed.

Key words： solid-state fermentation； compound bacteria； selenium-enriched； soybean pulp； response surface method

硒是动物体必需的微量元素之一[1]，在动物体内有多种功能，其基本作用是作为谷胱甘肽过氧化物酶的组成成分，参与消除已生成的过氧化物而起到保护细胞膜的作用[2]。硒摄入不足会引起仔猪的白肌病和桑葚心、猪的营养性肝病、产生PSE肉等动物缺硒疾病[3]。但如果直接在动物饲料中添加无机硒，安全性较差[4]。近年来，人们通过动物、植物、微生物作为转化载体来获取有机硒，取得了较大的进展[5]，如啤酒酵母液体富硒发酵等[6]，但液体发酵有机硒，成本高，废液排放量大，对环境污染大[7]。豆粕是动物饲料蛋白资源的首选，畜牧业需求旺盛，微生物发酵豆粕能够较好地利用豆粕的营养价值，降低抗营养因子，提高豆粕利用率，成为豆粕饲料应用的发展趋势[8]，但传统的堆积发酵豆粕，存在着发酵温度、水分不易控制，杂菌污染严重的问题。为此，本研究将有机硒转化和豆粕发酵结合起来，采用呼吸膜装置进行移动袋装固态发酵，将有机硒转化和发酵豆粕生产结合，已经转化的有机硒直接保留于豆粕原料中，豆粕大分子蛋白降解为可以被动物直接消化吸收的小分子蛋白，使得产品成为一种优质的、含微量元素硒的功能性蛋白饲料[9]。移动固体发酵富硒豆粕有效地解决了液体发酵有机硒的难题，且发酵过程中发酵占地少，温度、水分控制精确，杂菌污染少，生产效率大大提高，具有良好的实际应用前景[10]。本试验选用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、产朊假丝酵母（Candida utilis）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）4种菌株，通过移动袋装固态发酵技术复合发酵富硒豆粕，利用响应面分析法对其发酵条件进行优化，并对产品进行品质检验。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌种：地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌，均为冻干菌粉，龙岩学院微生物实验室保存，各有效菌经液体活化后活菌数均为1 010 个/mL。

豆粕：市场购买，蛋白含量40.26%（采用凯氏定氮法测定）。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程 多菌复合固态发酵富硒豆粕工艺流程如下：

发酵菌种→37 ℃红糖水活化

↓

发酵原料→混合→呼吸膜包装、密封→发酵（温度、时间）→检测产品（营养成分、有机硒含量）。

1.2.2 微生物菌株配比对豆粕富硒发酵的影响 采用地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌4种菌株，每种菌株活菌数取值1.0×1010 个/mL或2.0×1010个/mL，按L8（27）正交试验表安排8组代表各菌株用量的比例组合，将设定的各菌比例、总菌量按10%接种量加入37 ℃温水搅拌，活化20 min，温水中含总发酵物料10%红糖。菌株活化后，与89%豆粕、1%硫酸铵混合均匀，按15 mg/kg比例添加亚硒酸钠，并补充水分至总发酵物料的30%，用装量20 kg呼吸膜包装、密封，30 ℃发酵7 d，发酵后检测分析、对比产物各项指标，选定最适的菌株组合比例用于下一步响应面分析试验。各指标的检测方法参照国家饲料检测分析标准[11]，检测指标包括总菌数、粗蛋白、多肽、乳酸含量和有机硒转化率。菌体总数采用平板菌落计数法、粗蛋白采用凯氏定氮法、多肽含量测定采用三氯乙酸可溶性氮（TCA-NSI）法、乳酸含量测定采用试剂盒乳酸脱氢酶法，硒含量的测定采用3，3-二氨基联苯胺比色法[12]，有机硒的转化率=（总硒含量-无机硒含量）/总硒含量×100%[7]。

1.2.3 豆粕富硒发酵效果关键因素筛选的Plackett-Burman试验设计 在含呼吸膜的20 kg装量发酵袋中按设定的比例接入发酵原料（亚硒酸钠、豆粕、硫酸铵）、红糖水活化后的发酵混合菌株，并按比例补足水分，包装、密封，在设定的温度下进行发酵5～10 d，定时取样测定，检验发酵效果。采用响应面分析法中Plackett-Burman 试验设计，以白玉菇菌糠发酵后亚硒酸钠有机硒转化率为响应值筛选影响发酵效果的显著因素，Plackett-Burman试验设计因素和水平见表1。

1.2.4 豆粕富硒发酵效果的Box-Behnken响应面优化设计试验 在Plackett-Burman试验设计的基础上，选择对响应值影响显著的关键因素进行Box-Behnken响应面优化试验，确定影响豆粕富硒发酵效果的最佳工艺条件，并进行最佳工艺条件下的验证试验。

1.2.5 富硒发酵豆粕产品的品质检验 将未发酵前培养基的组成和最佳工艺条件下生产的富硒发酵豆粕产品进行品质检验，包括直观评价、pH、有机硒、粗蛋白、粗灰分、乳酸、总有益菌、胰蛋白酶抑制剂含量等，对比发酵前后各项指标的变化，分析豆粕富硒发酵后产品性能的变化情况。pH采用梅特勒FE.20 pH计测定；粗灰分采用坩埚灼烧法测定；总氨基酸含量采用S433D全自动氨基酸分析仪测定；粗纤维采用酸碱消煮法测定；粗脂肪采用索氏抽提法测定；脲酶采用酚红试剂法测定；生物素采用高效液相色谱法测定，以上各检测指标的检测方法同样参照国家饲料检测分析标准[11]，其他检测指标测定方法同上。胰蛋白酶抑制因子的测定参照GB/T 21498-2008[13]、植物血球凝集素测定采用凝集效价法[14]。

2 结果与分析

2.1 豆粕富硒发酵各微生物菌株配比的确定

各菌株质量浓度比按L8（27）的正交试验表设定，加入原料按工艺流程进行发酵，结束后检测分析产物各项指标，结果如表2所示。结果表明，各菌株试验组合中，当地衣芽孢杆菌菌体量比例高时，总菌数、多肽含量较高，培养基中剩余的粗蛋白含量较低，原因可能是地衣芽孢杆菌生长速度较快且其产蛋白酶能力较强[15]，所以能在发酵培养基中大量生长，分泌胞外蛋白酶降解豆粕粗蛋白获得大量的多肽，培养基中豆粕剩余的粗蛋白含量就较少；但当酿酒酵母、产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌含量较高时，对地衣芽孢杆菌的生长造成一定影响，因而总菌数降低、多肽含量降低、粗蛋白含量较高；嗜酸乳杆菌的生长有受到地衣芽孢杆菌的影响，当嗜酸乳桿菌含量较高时，培养基中的乳酸含量较高，而乳酸含量较高则有利于提高产品风味、刺激采食，但乳酸太高、酸味太重也会影响采食；各菌株对有机硒的转化率也有所不同，酿酒酵母、产朊假丝酵母菌体含量较高时，有机硒转化率较高。此外，由于具有富集硒和胞内大量积累谷胱甘肽（GSH）的功能，产朊假丝酵母近年来广泛应用于富硒酵母的制备，其不仅可以补充硒还可以提高机体的免疫力[16]。因此，综上所述，选定地衣芽孢杆菌∶酿酒酵母∶产朊假丝酵母∶嗜酸乳杆菌=2∶1∶2∶2的比例组合，此条件下各菌株能较好地协同生长、代谢，发酵产物的各项指标能达到较好的平衡。

2.2 豆粕富硒发酵效果关键因素的筛选结果

利用Minitab 15软件对表1的Plackett-Burman试验设计进行拟合和方差分析，结果见表3、表4。结果表明，影响豆粕富硒发酵效果的因素重要性排序是亚硒酸钠（X1）>豆粕（X3）>菌液接种量（X5）>发酵物料含水量（X6）>发酵温度（X7）>发酵时间（X8）>硫酸铵（X4）>红糖（X2）。其中，亚硒酸钠（X1）、豆粕（X3）、菌液接种量（X5）对响应值的影响达到了显著水平，因此，选定这3个水平进行正交试验分析。

2.3 Box-Behnken响应面优化设计试验结果

以有机硒转化率为响应值进行Box-Benhnken设计，三因素三水平的响应面设计及试验结果见表5。利用Design-Expert 7.0 软件对试验数据进行回归分析，得到响应值有机硒转化率和各因素变量之间的二元回归方程为Y=+55.74+1.75×A+1.09×B+0.21×C+0.62×A×B-0.28×A×C+0.61×B×C-1.68×A2-1.56×B2-1.54×C2，对回归模型进行方程分析，结果见表6所示。结果表明，该模型具有统计学意义（P< 0.000 1），失拟项不显著（P=0.070 8>0.05），表明回归方程拟合情况好，误差小，能较好地描述各因素与响应值之间的关系，可以利用该方程确定影响豆粕富硒发酵效果的最佳工艺条件。从各因素方差分析结果可以看出，对响应值有机硒转化率影响的大小顺序为亚硒酸钠（A）、豆粕（B）、菌液接种量（C），其中亚硒酸钠（A）和豆粕（B）对响应值结果影响显著。

各因素响应面曲面分析结果如图1所示，根据所得的模型可预测得到最佳豆粕富硒发酵工艺条件为亚硒酸钠19.43 mg/kg、豆粕91.38%、菌液接种量11.62%，在该条件下有机硒转化率能达到56.30%。分别按上述的最优工艺条件进行3次平行试验，所得有机硒转化率平均为55.48%，比Plackett-Burman试验设计时的响应值50.58% 提高4.9个百分比，与理论预测值56.30%接近，重复性较好，说明响应面优化所得的参数准确、可靠、可行，且能进一步优化试验条件，取得更优的试验结果。

2.4 富硒发酵豆粕产品的品质检验

富硒发酵豆粕发酵前后产品的品质检验结果如表7所示，结果表明豆粕富硒发酵后各项检测指标均得到了明显改善，其培养基中的无机硒转化成了有机硒，发酵后产生了大量的乳酸，pH下降，有较为明显的乳酸味、酒香味；发酵后富硒豆粕的粗蛋白、多肽、粗脂肪、总氨基酸、生物素等营养成分均明显高于发酵前，而畜禽不易利用的粗纤维成分含量降低，但干物质由于发酵过程中的损失而下降，粗灰分含量有所升高；发酵后豆粕中的脲酶、胰蛋白酶抑制剂、植物血球凝集素3种抗营养因子含量明显降低，符合国家《饲料添加剂安全使用规范》（中华人民共和国农业部公告第1224号，2009年）。

3 小结与讨论

本试验通过多菌联合发酵制备富硒发酵豆粕，发酵后其粗蛋白、多肽的含量有所增加，有利于满足动物体内蛋白需求，表明菌体发酵过程中能利用非蛋白氮转化为菌体蛋白，且菌体产生的各种胞外酶能有效地分解大分子蛋白为多肽，大大提高了豆粕蛋白的利用效率[17]。酵母菌近年來被广泛运用于豆粕的富硒发酵，其对有机硒的转化率较高，易生长、富集作用强[18]，特别是产朊假丝酵母还具有胞内大量积累谷胱甘肽的功能，不仅可以补充硒还可以提高机体的免疫力，是无机硒转化为有机硒的理想载体，本试验中无机硒的转化率达到了50%以上，效果显著，能有效地满足动物机体对硒的需求。枯草芽孢杆菌产酶量较高，其与酵母菌、乳酸菌混合发酵，有利于发酵豆粕中的多肽含量的增加，且枯草芽孢杆菌还能大量分泌纤维素酶，其添加有利于底物纤维素含量的降低[19]。此外，微生物发酵过程中，消耗了部分有机物，发酵后产品的干物质量有所减少，且由于发酵过程添加了多菌株等成分，发酵后产品灰分含量有所增加[20]。研究表明，经多菌株联合发酵，豆粕中脲酶、胰蛋白酶抑制剂、植物血球凝集素抗营养因子能够得到明显的消除，大大提高了豆粕的利用效率[21，22]，与本研究结果一致。添加的嗜酸乳杆菌使得发酵富硒豆粕产品的直观评价有了较为明显的改善，产品比发酵前出现了明显的乳酸味、酒香味，有利于刺激动物采食，提高饲料的利用率，降低料肉比，促进生长[23]。

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