1,25-(OH)2VitD3对人胰腺癌细胞侵袭迁移能力及MMP-2、9、14表达的影响

杨晟，刘声财，陈文华，胡腾腾，林军

(武汉大学中南医院，武汉430071)



1,25-(OH)2VitD3对人胰腺癌细胞侵袭迁移能力及MMP-2、9、14表达的影响

杨晟，刘声财，陈文华，胡腾腾，林军

(武汉大学中南医院，武汉430071)

目的观察1，25-二羟基维生素D3[1,25-(OH)2VitD3]对人胰腺癌PANC-1细胞侵袭迁移能力的影响，以及基质金属蛋白酶(MMP)-2、9、14的表达变化。方法 将不同浓度(0、25、50、75、100 μmol/L)的1,25-(OH)2VitD3作用于PANC-1细胞，干预24 h时分别用Transwell细胞侵袭、迁移实验观察细胞的侵袭和迁移能力，干预48 h时用Western blot法检测细胞MMP-2、9、14蛋白。结果 0、25、50、75、100 μmol/L的1,25-(OH)2VitD3干预PANC-1细胞24 h时，侵袭细胞数分别为(46.20±0.84)、(30.80±2.28)、(18.80±1.64)、(13.20±2.39)、(5.20±1.30)个/HP，迁移细胞数分别为(66.03±1.25)、(55.82±1.65)、(41.43±1.51)、(19.86±1.45)、(10.23±1.95)个/HP；随着1,25-(OH)2VitD3浓度增加侵袭及迁移细胞数逐渐减少，差异有统计学意义(P均<0.05)。1,25-(OH)2VitD3干预PANC-1细胞48 h后，随着1,25-(OH)2VitD3浓度增加PANC-1细胞MMP-2、9、14蛋白相对表达量逐渐减少，差异有统计学意义(P均<0.05)。结论 1,25-(OH)2VitD3可通过下调MMP-2、9、14蛋白的表达，从而抑制胰腺癌PANC-1细胞的侵袭与迁移。

胰腺癌；细胞侵袭；细胞迁移；1，25-二羟基维生素D3；基质金属蛋白酶

胰腺癌是高度致死性恶性肿瘤之一[1],肿瘤转移是导致患者死亡及预后差的原因之一[2]。以吉西他滨为基础的化疗方案是进展期胰腺癌的标准方案，但疗效并不尽如人意[3]。1，25-二羟基维生素D3[1,25-(OH)2VitD3]是一种脂溶性类固醇激素，有研究表明其可通过下调上皮细胞间质转化过程(EMT)和基质金属蛋白酶家族(MMPs)表达抑制肿瘤细胞的侵袭转移，从而发挥抗肿瘤作用[4～6]，但其抑制胰腺癌浸润转移的作用及其相关机制不甚明了。2015年11月～2016年5月，我们观察了1,25-(OH)2VitD3对胰腺癌PANC-1细胞侵袭、迁移能力的影响，以及MMP-2、9、14蛋白表达变化，进一步明确其阻止胰腺癌发生转移的机制。

1　材料与方法

1.1材料PANC-1细胞购自中国科学院上海细胞库；1,25-(OH)2VitD3购自美国Sigma公司，纯度为99.9%，用无水乙醇溶解稀释成100 mmol/L储存液，0.22 μm微孔滤膜过滤消毒，分装，4 ℃保存备用；RPMI 1640培养基、0.25%胰蛋白酶购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司；Transwell小室(24孔，8 μm孔径)为Corning公司产品、Matrigel基质胶为BD Biosciences公司生产；MMP-2、9、14兔抗人单克隆抗体、HRP标记的二抗、内参β-actin购自美国Abcam公司；其他常规生物化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2PANC-1细胞培养与处理PANC-1细胞用含10%胎牛血清、青链霉素双抗的RPMI 1640培养液在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中常规培养，隔天换液1次，3～4 d传代1次。取对数生长期细胞，用1,25-(OH)2VitD3进行干预，用RPMI 1640培养基稀释使其终浓度分别为0、25、50、75、100 μmol/L。

1.3PANC-1细胞侵袭能力观察采用Transwell细胞侵袭实验。将Transwell小室放入24孔板内，在小室底部膜的上室面均匀铺上50 μL稀释的Matrigel基质胶，室温风干。将不同浓度1,25-(OH)2VitD3干预24 h的PANC-1细胞用胰蛋白酶消化，调整细胞密度为1×105/mL。各取细胞悬液200 mL接种于小室的上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。常规培养24 h后取出Transwell小室，用棉签小心地擦掉上室面的Matrigel胶和细胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.5%结晶紫染液染色15 min，PBS洗3遍；显微镜下随机选取5个高倍视野并计数，取均值。实验重复3次。

1.4PANC-1细胞迁移能力观察采用Transwell细胞迁移实验，步骤与侵袭实验基本相同，只是Transwell小室底部膜的上室面未被Matrigel胶包被。

1.5PANC-1细胞MMP-2、9、14蛋白检测采用Western blot法。收集不同浓度1,25-(OH)2VitD3干预48 h的PANC-1细胞，用预冷的PBS漂洗2次后立即加入细胞裂解液，冰上裂解30 min；4 ℃离心5 min，提取细胞总蛋白用紫外分光光度法测定蛋白浓度。蛋白变性后上样，行SDS-PAGE分离后，电转膜至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭；加特异性一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min；加相应二抗室温孵育2 h，TBST洗去多余二抗；化学发光剂显色，应用BandScan凝胶图像分析软件分析结果。以目的蛋白条带与内参蛋白β-actin条带灰度比值表示目的蛋白相对表达量。

2　结果

2.11,25-(OH)2VitD3对PANC-1细胞侵袭迁移能力的影响随着1,25(OH)2D3浓度增加，侵袭及迁移细胞数逐渐减少(P均<0.05)。见表1。

表1　　　　不同浓度1,25-(OH)2VitD3对PANC-1细胞侵袭、迁移能力的影响(个

2.21,25-(OH)2VitD3对PANC-1细胞MMP-2、9、14蛋白表达的影响随着1,25-(OH)2VitD3浓度的增加,PANC-1细胞MMP-2、9、14蛋白相对表达量逐渐减少(P均<0.05)。见表2。

表2　　　　不同浓度1,25-(OH)2VitD3对PANC-1细胞MMP-2、9、14蛋白表达的影响

3　讨论

恶性肿瘤发生侵袭转移的基本步骤包括：原发肿瘤的增殖；肿瘤细胞侵犯毗邻基底膜和细胞外基质(ECM),ECM的降解；肿瘤细胞的趋化和游出，进入循环系统中存活并最终侵入血管、淋巴系统形成远处转移灶，以及新生血管的形成促使转移瘤快速生长等[7，8]。由此可知，肿瘤细胞发生侵袭转移的基础关键有两个：一是细胞通过对基底膜和ECM的降解，从而突破细胞间屏障进入循环系统或侵入靶器官；另一个就是形成远处转移灶后促进新生血管形成，从而加速转移瘤的生长。本研究结果表明，随着1,25-(OH)2VitD3浓度的增加，其抑制胰腺癌PANC-1细胞的迁移侵袭能力增强，提示1,25-(OH)2VitD3可能是针对这两个关键步骤从而在体外发挥抑制肿瘤侵袭转移的作用。

基底膜完整性破坏和ECM降解是肿瘤发生侵袭转移的先决条件，也是决定其恶性程度的一个重要因素[9]。有研究表明，肿瘤细胞必须先降解细胞外微环境的ECM和基底膜，然后通过细胞外的结合位点与ECM结合，进而溶解ECM并最终向外扩散、侵袭转移至邻近组织或远处靶器官。多种酶类可降解ECM中的大分子蛋白，其中MMPs在恶性肿瘤的浸润转移中发挥着重要作用[10]。MMPs是一组依赖锌离子、高度保守、具有多种生化性质的蛋白水解酶，目前已发现的MMPs成员达20多种，根据结构特征和作用底物的不同可分为5个亚类，MMP-2、9、14是这一家族中的重要成员。其中，MMP-2、9能特异性地降解基底膜的Ⅵ型胶原和明胶，破坏了基底膜的连续性和完整性，从而促进肿瘤的发展、侵袭及转移。吴俊本等[11]应用免疫组化染色法检测了30例胰腺癌及配对癌旁组织中MMP-2、9的表达，结果表明MMP-2、9在胰腺癌组织中呈高表达，且与肿瘤的恶性程度相关。Ren等[12]将纳入的28个研究进行Meta分析，结果表明MMPs尤其MMP-2、9在乳腺癌中充当独立的预后预测因子,其高表达者预后差。应用人工合成的基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)，如BB94可有效地抑制肿瘤的生长和转移。本研究应用1,25-(OH)2VitD3干预以后，MMP-2、9表达呈现出下调的趋势，并伴随着肿瘤细胞迁移侵袭能力的减弱。因此，我们推测MMP-2、9过表达引起的肿瘤细胞侵袭转移能力增强是导致肿瘤恶性进展的重要原因。

MMP-14是第一个发现的膜型MMPs，因此也被称为膜型的基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)。有研究发现，MMP-14在胰腺癌组织中的表达亦显著高于正常胰腺组织，但MMP-14的表达与患者的临床病理特征无关[13]。MMP-14可通过对Ⅰ型胶原和ECM的破坏使肿瘤浸润性生长，还能激活MMP-2、9的活性[14]，而后者在胰腺癌的侵袭转移中发挥着重要作用[15]。本研究结果显示，1,25-(OH)2VitD3干预以后，胰腺癌PANC-1细胞MMP-2、9、14蛋白表达均减低，并伴随着肿瘤细胞迁移侵袭能力的减弱。由此可见，1,25-(OH)2VitD3可通过影响MMPs的表达在胰腺癌的侵袭转移中发挥拮抗作用，MMPs有可能成为胰腺癌靶向治疗的一个新位点。

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Effect of 1,25(OH)2D3on migratory, invasive ability and expression of MMP-2, 9 and 14 of human pancreatic cancer cell line PANC-1

YANGSheng,LIUShengcai,CHENWenhua,HUTengteng,LINJun

(ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China)

ObjectiveTo investigate the effect of 1, 25-dihydroxyvitamin D3[1,25(OH)2D3] on invasive and migratory abilities of human pancreatic cancer cell line PANC-1 and the changes in the expression of matrix metalloproteinases (MMP)-2, 9 and 14. MethodsThe routinely cultured human pancreatic cancer cell line PANC-1 in vitro was treated with different concentrations of 1, 25(OH)2D3(0, 25, 50, 75 and 100 μmol/L). After 24 hours, the abilities of migration and invasion in vitro in each group were detected by Transwell migration and invasion assays. After 48 hours, the protein expression of MMP-2, 9 and 14 in each group was measured by Western blotting. ResultsAfter intervention for 24 h with different concentrations of 1,25(OH)2D3(0, 25, 50, 75 and 100 μmol/L), every field′s invasive cells in each group were (46.20±0.84), (30.80±2.28), (18.80±1.64), (13.20±2.39) and (5.20±1.30)/HP; and the migratory cells in each group were (66.03±1.25), (55.82±1.65), (41.43±1.51), (19.86±1.45) and (10.23±1.95)/HP, respectively. The migratory and invasive cells were decreased with the increase of concentration, and the difference was statistically significant (allP<0.05). After intervention for 48 h with different concentrations of 1,25(OH)2D3, MMP-2, 9 and 14 protein expression showed a declining trend with the increase of concentration, and the difference was statistically significant (allP<0.05). Conclusion 1, 25(OH)2D3can inhibit the invasion and migration of PANC-1 cells through down-regulating the expression of MMP-2, 9 and 14.

pancreatic carcinoma; cell invasion; cell migration; 1, 25-dihydroxyvitamin D3; matrix metalloproteinase

湖北省自然科学基金面上项目(2014CFB747)。

杨晟(1990-),男,硕士研究生，主要研究方向为消化系统肿瘤的防治。E-mail： 383104669@qq.com

简介：林军(1964-),男,博士,主任医师,主要研究方向为消化系统肿瘤的防治。E-mail: linjun64@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.006

R735.9

A

1002-266X(2016)34-0017-03

2016-06-06)