温敏含糖嵌段共聚物的合成及其胶束的自组装*

周开春，徐慕儒，武俊紫，权　静,2

(1.东华大学 化学化工与生物工程学院，上海 201620; 2.东华大学 生态纺织教育部重点实验室,上海 201620)



温敏含糖嵌段共聚物的合成及其胶束的自组装*

周开春1，徐慕儒1，武俊紫1，权静1,2

(1.东华大学 化学化工与生物工程学院，上海 201620; 2.东华大学 生态纺织教育部重点实验室,上海 201620)

采用酶促法合成含半乳糖单体6-O-乙烯基壬二酸-D-吡喃型半乳糖酯(OVZG),采用可逆加成-链断裂转移自由基聚合法(RAFT聚合)将大分子引发剂二聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA)和OVZG有效结合，制备相对分子质量(简称分子量)分散系数(PDI)较低的温敏性含半乳糖嵌段共聚物PDEGMA-b-POVZG。通过核磁共振氢谱(1H NMR)，傅里叶变换红外光谱(FT-IR)，凝胶渗透色谱(GPC)对聚合物结构进行了确认表征。通过紫外-可见光谱(UV-Vis)研究表明，共聚物的低临界溶解温度(LCST)可以通过共聚单体的比例进行调控，当PDEGMA与OVZG的物质的量之比为1∶63时，含糖共聚物的LCST值为33℃。在37℃生理温度下，PDEGMA-b-POVZG可以自组装形成纳米胶束，透射电子显微镜(TEM)显示自组装形成的聚合物胶束是结构均匀、形貌规整的球形，通过动态光散射(DLS)测得纳米微球的粒径约为167 nm，该温敏性半乳糖嵌段共聚物在药物载体方面具有潜在的应用前景。

温度敏感性；含糖嵌段共聚物；LCST；自组装

0　引　言

近年来，随着两大新型活性聚合反应可逆加成-断裂链转移自由聚合(RAFT)和原子转移自由基聚合(ATRP)[1]的广泛应用，使得可控聚合迅速发展起来。RAFT聚合由于其适用单体范围较广，反应过程比较简单，所以成为合成具有生物医药用途的含糖聚合物的最佳方法之一。Lowe[2]等首次使用RAFT聚合法合成了分子量分散窄的含糖均聚物。

温敏性双亲水含半乳糖嵌段共聚物是一类特殊的两亲性共聚物,在温度变化的诱导下可以转化为两亲性,从而形成对温度变化敏感的聚集体[3]。半乳糖单体作为1种具有良好的亲水性、细胞靶向识别性、生物相容性和生物降解性可被聚合到温敏单体中形成温敏性双亲水含半乳糖嵌段共聚物。而二聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA)是一类具有良好生物相容性，因而成为最常用的温敏单体之一。由于其结合了半乳糖基的生物相容性、细胞靶向识别性和温度敏感单体的环境刺激-响应性，使其在药物传递和基因治疗领域具有潜在的应用价值而备受关注。

以胶束为载体的给药系统具有被动靶向的性能，将药物包封或嵌入到胶束后能选择性地聚集于靶组织并达到缓慢释放药物的目的，以更好地发挥药物的疗效。Wang[4]等研究表明，含半乳糖的嵌段共聚物胶束可以特异性靶向HepG2肝细胞。Voit等[5]研究表明，与聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAm)相比，DEGMA结构中没有酰胺键，不易与生物体中的蛋白质、多肽发生化学反应，因而可广泛运用于生物体内。同时，还表明将DEGMA与含糖单体聚合所得的共聚物兼具温敏性，细胞靶向性和生物相容性[6-7]。

本文通过可逆加成-断裂链转移自由基聚合(RAFT聚合法)，将温敏性单体二聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA)和具有肝靶向性的含半乳糖单体6-O-乙烯基壬二酸-D-吡喃型半乳糖酯OVZG进行嵌段共聚，制备分散度窄的半乳糖基温敏性双亲水嵌段共聚物。通过对嵌段聚合物胶束的LCST的测定，聚合物在温度高于33℃时，可以自组装形成规整的球形纳米胶束[8-9]。

1　实　验

1.1主要试剂及仪器

枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(100 U/mg，无锡雪梅科技有限公司)、偶氮二异丁腈(AIBN，国药集团化学试剂有限公司，AR)、壬二酸(国药集团化学试剂有限公司，AR)、二聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA，Sigma-Aldrich，AR)、醋酸乙烯酯(国药集团化学试剂有限公司，AR)、半乳糖(国药集团化学试剂有限公司，AR)、S-氰甲基-N-甲基-N-(4-吡啶基)氨基二硫代碳酸酯(CMPCD，Sigma-Aldrich，AR)，其余药品均为分析纯，购自国药化学试剂有限公司。

Waters1525/2414 BI-MwA型凝胶渗透色谱(GPC)-散射(LS)联用仪(美国Waters，Brookhaven公司，色谱柱的型号为Waters Styragel HT)、Avance400型核磁共振波谱仪(瑞士Bruker 公司)、紫外可见分光光度计(Lambda 35，美国PerkinElmer公司)、透射电子显微镜(JEM-2100，日本JEOL公司)、傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet 6700，美国Thermo Fisher公司)、激光光散射仪(BI-200SM,美国Brookhaven公司)。

1.2PDEGMA-b-POVZG的合成

在枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的催化下经过转酯反应获得OVZG[10]。制备大分子引发剂，取1.13 g DEGMA、13.4 mg链转移剂 CMPCD、引发剂 AIBN 2.1 mg，用 2 mL DMF溶剂溶解，经过3次抽真空-充氮气处理，于70℃油浴中反应1 h，然后置于冰水浴中冷却5 min。把反应产物用二氯甲烷溶解后，正己烷沉淀反复2～3次后，放入真空干燥箱干燥，得到0.83 g 黄色油状物，即得大分子引发剂PDEGMA[11-12]。用RAFT 聚合合成PDEGMA-b-POVZG。OVZG与PDEGMA物质的量之比分别为63∶1。反应以DMF 为溶剂，以偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，单体、链转移剂、引发剂的物质的量之比为63:1:0.21，单体的质量浓度为1 kg/L。取301.7 mg PDEGMA、239.7 mg OVZG、0.35 mg AIBN 溶于0.5 mL DMF 中，经过3次抽真空-充氮气处理，于70℃油浴中反应48 h，然后置于冰水浴中冷却5 min。把反应产物用二氯甲烷溶解，正己烷沉淀，如此反复2次，放入真空干燥箱干燥，得到0.23 g 黄色油状物。合成路线如下所示

1.3聚合物表征

1.3.11HNMR测定

将反应单体OVZG、PDEGMA 和合成的产物PDEGMA-b-POVZG通过1H NMR(400MHz；DMSO 或 CDCl3，Me4Si)进行表征。

1.3.2傅里叶红外光谱测定

将反应单体 OVZG、PDEGMA 和合成的产物 PDEGMA-b-POVZG，通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)进行表征。

1.3.3凝胶渗透色谱(GPC)

将聚合物 PDEGMA-b-POVZG 溶于四氢呋喃配制4 g/L的溶液，通过凝胶渗透色谱(GPC)测试其分子量和分散度(PDI)。使用已知分子量的聚苯乙烯溶液作为标准参比分子。

1.3.4聚合物LCST值测定

将聚合物配制成1 g/L的水溶液放在带有变温池的紫外可见分光光度计中，测其在500 nm处的吸光度(A)随温度(T)变化的情况。测试条件：升温范围25～55℃，升温速率为0.5℃/min。

1.3.5动态光散射测试(DLSC)

将 PDEGMA-b-POVZG 溶解在双蒸水中，制备成质量浓度为0.5 g/L的溶液。用0.45 μm的水相过滤膜将样品进行过滤，然后加入到干净的样品测试瓶中。使样品室的温度保持在25℃，在532 nm下进行动态光散射测试。

1.3.6胶束形貌的透射电子显微镜(TEM)表征

将嵌段聚合物溶解在三蒸水中，让其自组装形成胶束，然后将胶束溶液滴在备好的铜网上使水分蒸发制得样品，通过透射电子显微镜观测其表面形貌。

2　结果与讨论

2.1核磁共振氢谱

图1为反应单体 OVZG、DEGMA 和合成产物 PDEGMA-b-POVZG的核磁共振氢谱。

图1OVZG、DEGMA、PDEGMA-b-POVZG 的核磁共振氢谱(1HNMR)

Fig 11HNMR spectra of OVZG,DEGMA and PDEGMA-b-POVZG

2.2红外光谱

图2PDEGMA、OVZG、PDEGMA-b-POVZG的红外光谱图

Fig 2 IR spectra of PDEGMA,OVZG and PDEGMA-b-POVZG

2.3GPC

图3为PDEGMA-b-POVZG的GPC 图，可发现其为对称单峰。GPC 测试结果表明，聚合产物多分散系数为1.55，聚合物的质均相对分子质量(Mw)为120 600，其数均相对分子质量(Mn)为77 600。

图3　共聚物凝胶渗透色谱(GPC)图

2.4PDEGMA-b-POVZG共聚物的温度敏感性

将嵌段聚合物(PDEGMA-b-POVZG)溶液放在带有变温池的紫外可见分光光度计中，测其在500 nm 处的吸光度(A)随温度(T)变化情况，如图4 所示。

图4PDEGMA-b-POVZG水溶液在500 nm处的吸光值A 曲线

Fig 4 Absorbance curves recorded for solution of PDEGMA-b-POVZG in water

根据定义[14]，低临界溶解温度(LCST)为达到溶液最大吸光度(A)50%时的温度值。图中可以看出该嵌段共聚物PDI的LCST值为33℃。可见，PDEGMA-b-POVZG的LCST 值与人体的温度比较接近。当温度降到LCST以下时，胶束溶液又从混浊变得澄清，表明此类温度敏感胶束的相转变即溶解-不溶的转变，这种转变是可逆的。又由于 PDEGMA-b-POVZG的LCST 值为33℃，低于人体温度，在人体环境中可以快速形成纳米胶束，使其在体内药物载体方面具潜在应用。

2.5动态光散射测试

图5是 PDEGMA-b-POVZG 通过动态光散射得到的流体力学直径图，可发现其同样为对称单峰，且分布较为集中。平均粒径为167 nm。

图5　共聚物动态光散射(DLS)图

2.6聚合物胶束的自组装

图6是质量浓度为0.5 g/L的嵌段聚合物溶液形成的胶束的表面形貌。

图6　聚合物自组装胶束透射电镜(TEM)图

Fig 6 TEM images of micelles self-assembled from PDEGMA-b-POVZG at low and high magnification

通过TEM的低倍和高倍图可以观察到，聚合物胶束为比较规整但表面不平滑的球形结构，粒子的大小比较均匀，粒径约为167 nm。由于在制备TEM样品时的温度是50℃高于嵌段共聚物的LCST值33℃，所以可以形成比较规整的球形结构。但又由于制样过程中胶束中的水分蒸发，因此，粒径小于DLS测试得到的结果。同时胶束会发生不同程度的坍缩，使得胶束的表面出现不同程度的凹凸现象[15]。在PDEGMA-b-POVZG中，OVZG与PDEGMA 通过主链连接起来。常温下溶于水后主链无规成团，温度升高至LCST值后，温敏部分 PDEGMA 向内发生塌缩，而含有半乳糖基部分OVZG位于胶束表面。

3　结　论

通过酶促合成/RAFT聚合的方法在链转移剂S-氰甲基-N-甲基-N-(4-吡啶基)氨基二硫代碳酸酯(CMPCD)的作用下，将含半乳糖单体OVZG与温敏性单体PDEGMA进行可控聚合制备了分散度小且具有温敏性双亲水性的共聚物。当OVZG与PDEGMA 物质的量之比为63∶1时，LCST值为33℃，低于人体温度。在此条件下可以成功形成结构规整的胶束，为该类材料在肝靶向药物载体方面的应用奠定了基础。

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Synthesis and self-assemble of thermosensitive galactose block polymer

ZHOU Kaichun1，XU Muru1,WU Junzi1,QUAN Jing1,2

(1.Donghua University,College of Chemistry,Chemical Engineering and Biotechnology, Shanghai 201620,China；2.Donghua University,Key Laboratory of Textile Science & Technology,Ministry of Education, Shanghai 201620,China)

The glycomonomer 6-O-vinylazelaic-D-galactopyranose(OVZG)was synthesized by lipase catalyzed transesterification of divinyladipate with D-galactopyranose.PDEGMA-b-POVZG with narrow polydispersity(PDI)and obvious thermosensitivity was effectively prepared via enzymatic synthesis combined with reversible addition-fragmentation chain transfer(RAFT)polymerization.The structure and molecular weight of the synthesized glycopolymer were characterized by1HNMR,FT-IR and gel permeation chromatography(GPC),respectively.Measurement by dynamic light scattering(DLS)and transmission electron microscopy(TEM)revealed that PDEGMA-b-POVZG was able to self-assemble into nano-micelles with well-defined structure and uniform size in aqueous solution.UV-Visible spectroscopy tests showed that the low critical solution temperature(LSCT)of the polymer can be controlled by the molar ratio of monomers.Especially,as the molar ratio of PDEGMA and OVZG was 1∶63,the LCST of PDEGMA-b-POVZG could be 33℃ in aqueous solution.The results demonstrate that PDEGMA-b-POVZG can form nano-micelles in the human body environments,which may have potential as functional drug carriers.

thermosensitivity；glycopolymer block；LCST；Self-assemble

1001-9731(2016)09-09158-05

国家自然科学基金资项目(21303014)

2015-06-08

2016-04-04 通讯作者：权静，E-mail:jquan@dhu.edu.cn

周开春(1990-)，男，安徽滁州人，硕士研究生，师承权静副教授，主要从事药物缓释材料研究。

O631；TQ316

ADOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.09.030