拉曼光谱法分析凡纳滨对虾冻藏过程蛋白质与水分结构变化

袁　丽，纪　秀，石　彤，王艳敏，高瑞昌*

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013）

拉曼光谱法分析凡纳滨对虾冻藏过程蛋白质与水分结构变化

袁丽，纪秀，石彤，王艳敏，高瑞昌*

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013）

探明冻藏过程中凡纳滨对虾肌肉蛋白质与水分的结构变化有助于揭示蛋白质冷冻变性机理，采用拉曼光谱技术对凡纳滨对虾肌肉蛋白质在不同冻藏温度条件下的二级结构进行分析，并结合重水置换技术表征肌肉蛋白质的氘代动力学，从蛋白质结构和表层水分子角度研究冻藏温度对蛋白质冷冻变性的影响。结果表明：冻藏过程中蛋白质的二级结构由规整转向松散，肽链展开，且-18 ℃冻藏的蛋白质结构松散性比-40 ℃显著；伴随蛋白质结构的展开，表面疏水性增加，蛋白质与表层结合水的相互作用减弱，且冻藏温度越高，相互作用减弱越剧烈，蛋白质结构也越不稳定，水分越容易流失；而冻藏温度越低，蛋白质与水分的相互作用越强，蛋白质结构越稳定，越有利于保持对虾原有品质。

凡纳滨对虾；蛋白质二级结构；水；冻藏；拉曼光谱；重水置换

我国有一半以上的加工水产品为冷冻产品，大量水产品得以顺利走入市场依赖于冷冻保藏技术的发展［1］。凡纳滨对虾肉质鲜嫩、营养丰富，是深受人们喜爱的水产品之一。冻藏是凡纳滨对虾贮藏与加工的必要手段，然而在冷藏或冻藏过程中，肌肉蛋白质容易发生冷冻变性，造成食用品质下降，影响产品质量［2］。实质上，蛋白质的变性是指在某些物理化学作用下，蛋白质的二级结构和三级结构发生改变，分子内部构象出现变化，生物活性也随之变化。水产品动物蛋白质在特定因素的作用下（如冻藏），分子结构从有序结构可以转变成无序结构，呈现不同的构象，同时分子的功能特性减弱或消失，最终导致产品品质下降［3］。目前对于水产品冷冻变性的评价指标主要依赖Ca-ATPase活性、蛋白溶解度等蛋白质生化特性［4-8］，而从冷冻水产品蛋白质自身结构变化的角度研究较少。

拉曼光谱技术被证实是研究蛋白质构象的一个重要手段，具有快速、无损、不受水溶液影响的特性［9-11］。最近有研究［12］表明，拉曼光谱还可以用于研究蛋白质和水的相互作用、水变化对蛋白质结构的影响，O—H键的伸缩振动是研究水和蛋白质的相互作用的主要依据。氢/氘交换技术主要运用于核磁共振波谱法对蛋白质的研究中，利用氘代后质量的不同区分氢原子的化学位移变化［13］，也被用来研究蛋白质构象二、三级结构及分子活动性［14-16］。本研究采用拉曼光谱技术对冷冻对虾的蛋白质进行二级结构分析，结合重水置换技术，分析重水峰峰强变化、O—H/C—H的峰面积比和特征谱带的相对强度变化，表征蛋白质冷冻变性过程中蛋白质与水分子的相互作用强弱，阐述冻藏温度对凡纳滨对虾肌肉蛋白质结构变化的影响，从蛋白与水结构变化角度阐释蛋白质冷冻变性机理。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜凡纳滨对虾 欧尚超市。

重水（纯度99%） 美国Sigma公司；其他化学试剂（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

VERTEX 70傅里叶变换拉曼光谱 德国Bruker公司；透析管（3 500～5 000 D） 美国Spectrum公司。

1.3方法

1.3.1样品预处理

取新鲜对虾和不同冻藏条件下的对虾样品，去头尾，去皮，切成肉糜状后置于4 ℃条件下备用，用于重水交换和拉曼光谱的测定。

1.3.2拉曼光谱测定

参考Sánchez-gonzález等［14］的方法进行氢/氘同位素交换，将对虾肉糜置于透析管中，再放置在D2O中进行交换，15 ℃分别处理0、1、3、5、7 h。用傅里叶拉曼光谱仪进行扫描，激光器波长为1 064 nm，分辨率为4.0 cm—1，激光功率为300 mW，保持15～20 ℃恒温，累计扫描2 000 次，每个样品扫描2 遍，用OPUS软件记录下位移范围在400～4 000 cm—1的拉曼光谱。

1.3.3凡纳滨对虾肌动球蛋白表面疏水性的测定

1.3.3.1凡纳滨对虾肌动球蛋白的提取

取2 个冻藏温度不同冻藏时间的凡纳滨对虾，去头尾、去皮、肌肉组织匀浆，随后加入4 倍体积的磷酸缓冲液（pH 7.0），3 000 r/min离心10 min，倾去上清液，再加入磷酸缓冲液进行离心，重复3 次。将去除杂质的肌肉蛋白加入3 倍体积的磷酸盐缓冲液，静置过夜，再经8 000 r/min离心15 min，然后将上清液用2 层纱布过滤，滤液缓慢倒入10 倍体积冷却蒸馏水中，用15%醋酸调节pH值至6.5～6.6，随后再静置4～5 h，经6 000 r/min离心10 min得到沉淀，然后再用0.6 mol/L KCl溶液溶解沉淀，放入0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-maleate缓冲液中透析一夜。将透析后的溶液10 000 r/min离心1 h，取上清液缓慢倒入10 倍体积的冷却蒸馏水中，再次稀释沉淀，即得到精提的肌动球蛋白样品，所有操作均在低于4 ℃环境下进行，制备的样品置于冰上保存待用。

1.3.3.2肌动球蛋白疏水性的测定

参考Yongsawatdigul等［17］的方法，将上述蛋白质样品溶解于0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸缓冲液中，使肌动球蛋白质量浓度（C）范围落在0.05～10.8 mg/mL，取8 mmol/L的8-苯胺基萘-1-磺酸盐40 μL，与4 mL样品溶液置于黑暗处反应10 min，用磷酸缓冲液做空白对照。设定荧光分光光度计的狭缝校正5 nm，激发波长为386 nm，发射波长为478 nm，测定相对荧光强度（R），由R与C的比值可得肌动球蛋白的疏水性。

1.3.4氘代动力学分析

氘代动力学表征为凡纳滨对虾肌肉蛋白质在重水置换的动态过程中，重水中的OD与蛋白质和水分子中的CH、OH相互置换的强弱能够反映蛋白质分子和水分子的相互作用的变化情况。计算方法定义为未置换的对虾蛋白质样品中拉曼光谱中的O—H/C—H的面积比值为1，以置换时间为横坐标，O—H/C—H面积比的变化情况为纵坐标做散点图并拟合得到不同冻藏温度条件下的氘代动力学变化图［14］。

1.4谱图处理

将得到的拉曼图谱在OMNIC软件上进行平滑和基线校正处理，在Peakfit软件上进行去卷积和求二阶导数，以利于区别重叠子峰，用曲线拟合处理，得到图谱的峰强和峰面积，用Orign 8.0软件作图。

2　结果与分析

2.1冻藏凡纳滨对虾肌肉蛋白二级结构变化

拉曼波谱主要来源于蛋白质分子中的C—N键和C=O键的伸缩振动，拉曼图谱中1 655 cm-1附近的酰胺Ⅰ带的变化与蛋白质主链构象的各种二级结构含量变化密切相关［11，18］。但是实验中由于表征蛋白质二级结构构象的多个振动吸收峰易重叠在一起，拉曼光谱图谱中容易出现宽峰，因此常运用去卷积和曲线拟合的方法来区分不同的重叠谱带，得到单个谱带的信息。蛋白质的二级结构是指在肽链中部分肽段的骨架所形成的结构，它主要包含α-螺旋、β-折叠、转角、卷曲结构和环形等不同的类型［19］，其中α-螺旋结构表征蛋白质分子的规整性，β-折叠和转角结构反映蛋白质分子的松散性。

表1　-18 ℃冻藏条件下的凡纳滨对虾肌肉蛋白质二级结构的含量变化Table1　Changes in secondary structure contents of whiteleg shrimp muscle protein frozen at -18 ℃%

表2　-40 ℃冻藏条件下的凡纳滨对虾肌肉蛋白质二级结构的含量变化Table2　Changes in secondary structure contents of whiteleg shrimp muscle protein frozen at-40 ℃%

从表1、2可以看出，肌肉蛋白质α-螺旋结构的含量在-18 ℃和-40 ℃冻藏温度条件下均随冻藏时间的延长呈下降趋势，分别下降35.76% 和27.23%。而肌肉蛋白质的β-折叠和转角含量在-18 ℃和-40 ℃冻藏条件下整体上呈上升趋势，同一冻藏时间内两种冻藏样品间的β-折叠含量差异不明显，但是转角则表现为冻藏温度越高其含量随贮藏时间延长上升越大。缪松等［20］研究了冻藏过程中的扇贝的质量变化，结果表明冻藏温度不同能造成蛋白质的变性程度的不同，在-25 ℃冻藏温度条件下扇贝蛋白质的变性速度显著低于-18 ℃冻藏温度条件下的扇贝。Herrera等［21］也报道在-10 ℃和-30 ℃两个冻藏温度条件下鱼肉蛋白质的二级结构均会发生变化，但-10 ℃的结构变化更加明显。结果显示，在2 个冻藏温度条件下，凡纳滨对虾肌肉蛋白质随着冻藏时间的延长发生了较大变化，其中α-螺旋结构的含量减少，β-折叠和转角结构的含量增加，可能发生了α-螺旋结构向β-折叠和转角结构的转化。如前所述，蛋白质分子的α-螺旋结构的降低和β-折叠和转角结构的升高意味着蛋白质结构由规整向松散转化，并且与冻藏温度存在相关性，温度越高，结构松散性越明显。

2.2冻藏凡纳滨对虾肌肉蛋白质表面疏水性的变化

图1　冻藏期间对虾肌动球蛋白表面疏水性变化Fig.1　Changes in surface hydrophobicity of shrimp myosin during frozen storage

由于表面疏水性测定要求蛋白纯化程度较高，所以实验中通过提取对虾肌肉蛋白质主体部分肌动球蛋白进行测定，以表征肌肉蛋白质的表面疏水性变化趋势。由图1可知，随冻藏时间的延长，肌动球蛋白的表面疏水性总体呈上升趋势，且冻藏温度越高，表面疏水性越高。在冻藏前4 周，对虾肌动球蛋白的表面疏水性均增加显著，-18 ℃和-40 ℃条件下的样品增加幅度分别为75%

和74%。之后的4～12 周，-18 ℃条件下冻藏样品的表面疏水性仍有较大幅度上升，而-40 ℃条件下冻藏样品的表面疏水性上升幅度趋于平缓。蛋白质的表面疏水性是由蛋白质分子表面疏水性氨基酸的相对含量决定的，对于某些蛋白质，表面疏水性的增加反映了蛋白质的变性程度的增加。低温冻藏过程中，虾肉蛋白质表面疏水性的增加归因于蛋白质的去折叠和或伸展导致疏水性脂肪族和芳香族氨基酸的暴露，是表征蛋白质变性的重要指标之一。结果与前面所述的凡纳滨对虾蛋白质二级结构改变规律一致，蛋白质结构由规整转变为松散。

2.3冻藏凡纳滨对虾肌肉蛋白质氘代后的重水峰强度变化

图2　肌肉蛋白质氘代前后的拉曼光谱图Fig.2　Raman spectra of shrimp muscle protein before and after H/D exchange

利用拉曼光谱法和同位素氢/氘置换技术测定凡纳滨对虾肌肉蛋白质在不同冻藏温度条件下其分子内及表面的氢和重水中的氘相互置换的程度变化规律，探索蛋白质表面水分子在冷冻变性过程中的变化规律。如图2所示，2 500 cm-1附近的拉曼谱带表征O—D键的伸缩振动，此波带附近的拉曼强度值的变化可表征虾肉蛋白质的重水置换程度，强度越高代表重水置换程度越高，即蛋白质分子内部和表层可置换的氢原子越多。因此实验利用此峰的强度变化来表征蛋白质与水分子的相互作用强弱变化，同时也可表征蛋白质结构变化。Khoshtariya等［22］用光谱研究水合牛血清蛋白质的高度可极化水-水氢键和界面渗透网络时表明，位于3 260、2 840 cm—1处有非常宽的OH亚键，OD键相应的处于2 350、2 050 cm—1，被指这些键是水分子的伸缩振动，包括水-水氢键和蛋白质-水相互作用。

图3 -18 ℃（a）和-40 ℃（b）条件下对虾肌肉蛋白质重水置换的拉曼图谱重水峰强度变化Fig.3　Raman intensity of H/D isotopic exchange for whiteleg shrimp muscle protein stored at -18 ℃ and -40 ℃

图3为-18 ℃和-40 ℃冻藏条件下不同冻藏时间的O—D键的拉曼强度值变化，表征凡纳滨对虾肌肉蛋白质氘代程度变化。结果显示，无论是新鲜还是冻藏后的样品，2 500 cm—1附近的拉曼谱带强度都随置换时间延长而增加，并且实验过程中发现，拉曼强度在置换7 h后趋于稳定，特别是-40 ℃条件下的样品更明显。-18 ℃条件下冻藏8 周的未氘代样品的拉曼强度是0.001 2 cps，氘代7 h后拉曼强度增加到0.011cps；而相应的-40 ℃条件下样品氘代后拉曼强度从0.001 1 cps增加到0.007 cps。表明冻藏温度越低，样品氘代后的重水峰变化越集中，规律越明显，而温度升高（-18 ℃），样品的氘代变化曲线比较分散，变化趋势不集中。这可能与蛋白质变性密切关系，如前所述，凡纳滨对虾肌肉蛋白质在-18 ℃的变性程度要高于-40 ℃，二级结构的展开程度也更明显，转角的含量和表面疏水性也高于-40 ℃冻藏同时间的样品。在蛋白质变性过程中，稳定结构变为松散结构即由α-螺旋形成了β-折叠和转角，形成的β-折叠又进一步解散成转角和无规则卷曲，导致原有氢键网络的破坏和疏水面的增加，原来与蛋白质密切结合的表层甚至内部维持蛋白质结构的水分子被暴露出来，同时蛋白质的氨基酸残基的NH也暴露出来，从而提供了更多可与重水置换的氢原子，产生较高的氘代，随着置换进行可置换氢不断减少直至置换饱和，峰强度趋于稳定。结果显示冻藏温度越低，蛋白质结构越规整，其可置换的氢原子越少，原有水分子与蛋白质相互作用未被破坏，也可以理解为表层结合水分子的保留有助于稳定蛋白质结构。

2.4冻藏凡纳滨对虾肌肉蛋白质的氘代动力学

图4　-18 ℃（a）和-40 ℃（b）条件下冻藏凡纳滨对虾肌肉蛋白质未氘代分数变化Fig.4　Kinetics of H/D exchange for whiteleg shrimp muscle protein stored at -18 and -40 ℃

由图4可知，置换前3 h的数据显示，随冻藏时间延长，未氘代分数显著下降，即氘代分数显著增加，且未氘代分数的降低与冻藏时间呈正相关。这可能与蛋白质在冻藏过程中二级结构含量的变化密切有关，-18 ℃条件下冻藏4 周的蛋白质α-螺旋结构含量减少，β-转角和β-折叠结构含量增多，蛋白质结构松散，暴露出充足的可氘代的氢，所以氘代程度随冻藏时间延长而增加，未氘代分数降低。而置换3 h之后未氘代分数变化不明显，甚至变性程度高的样品未氘代分数反而会增加，分析可能的原因有：1）-18 ℃条件下，冻藏时间越长，α-螺旋和β-折叠结构含量变化越大，蛋白质的变性程度越剧烈，疏水作用增强，重水置换难度增加，导致冻藏第4、8周的未氘代分数值上升；同理，-40 ℃条件下，冻藏时间延长，蛋白质的二级结构变化及疏水作用共同影响蛋白质的氢/氘交换作用，使得冻藏第8周的蛋白质未氘代分数值上升。2）随着置换时间的延长，使疏水作用增强，蛋白质继续变性，疏水作用能力大于氢/氘交换作用力，阻止了氢/氘的交换作用，导致未氘代分数值增大［23］。3）冻藏时间延长，蛋白质聚集增大，导致氢/氘交换作用中表面溶剂接触面积减小，也会影响未氘代分数值的变化。

表3　-18 ℃和-40 ℃条件下的凡纳滨对虾肌肉蛋白质氘代速率（k值）Table3　Changes in H/D exchange ratio for whiteleg shrimp muscle protein stored at -18 and -40 ℃

在置换的前3 h内，O—H/C—H的面积比随置换时间的延长，呈线性减小的趋势，且在不同冻藏时间条件下，氘代动力学的变化趋势相同，但氘代程度不同。以拟合直线的斜率为氘代速率，表示为k值。由表3可知，氘代速率k值随着冻藏时间的延长而不断增大，且冻藏温度越高，k值越大，说明随蛋白质变性的进行，蛋白质与表层结合水的相互作用逐渐减弱，反之可理解为随水分子的丢失和转移促进了蛋白的变性。冻藏2 周后，-40 ℃条件下的氘代速率为0.108 6，而-18 ℃冻藏温度条件下的氘代速率为0.139 3，分别比未冻藏的蛋白质分子的氘代速率增加0.009 6和0.040 3。冻藏过的蛋白质由于结构发生变化，蛋白质与水分子的作用减弱，导致同一置换时间可氘代氢的数量多于未冻藏的新鲜样品，因此氘代速率大。在-40 ℃条件下冻藏与-18 ℃相比，具有相对稳定的蛋白质肽链结构，蛋白质与表层结合水相互作用保持较强的状态，表层水分子较稳定，所以可被氘代氢的数目较少，故氘代速率相对较低。氢/氘同位素交换初期，氘代主要发生在与蛋白质表层水分子中的O—H键，随着氘代的进行，氘代可与蛋白质中的酰胺键的N—H甚至内部的水分子发生置换。在不同冻藏温度条件下，氘代速率k值变化可能是冻藏过程中α-螺旋结构减少速率不同即肽链展开程度不同引起的。蛋白质二级结构展开程度的不同造就了氢原子的暴露出现差异，因此蛋白质二级结构含量的变化和氘代速率的差异密切相关，且冻藏温度是引起差异的根本原因。此外，氘代动力学的快慢可能与蛋白质中水的氢键强度相关，氢键强度越高，动力学越慢，因此蛋白质结构稳定性越高，氘代速率越低。这与Ignacio等［14］研究具有相似性的结论，-40 ℃条件下的冻藏蛋白质与结合水的氢键更稳定，所以氘代动力学较慢。

结果显示，在不同的冻藏温度条件下，蛋白质发生变性的速率不同造成了二级结构的展开存在差异，蛋白质与表层结合水的相互作用随展开程度提高而减弱，蛋白质表层的结合水暴露程度也存在区别。可置换氢增加表明蛋白质与水分子相互作用的减弱，也意味着水分流失增加，最终导致鲜嫩的对虾制品经冻藏后品质变差，且冻藏温度越高，品质变化越大，而冻藏温度越低，越有利于保持蛋白质天然特性。

3　结 论

在-18 ℃和-40 ℃冻藏温度条件下，凡纳滨对虾蛋白质均发生变性，蛋白质分子的二级结构由紧密向松散发展，肽链逐渐展开，且冻藏温度越高，结构松散性越明显。蛋白质的未氘代分数随冻藏时间延长显著下降，即氘代分数显著增加，在一定冻藏时间内，未氘代分数与冻藏时间存在正相关性。伴随蛋白质的展开而结构趋于松散，疏水性增加，蛋白质与表层结合水相互作用减弱，且冻藏温度越高，这种相互作用越弱，意味着蛋白质周围的水分越容易流失；而冻藏温度越低，蛋白质与表层结合水相互作用越强，结构稳定性越高，蛋白质变性速率越慢，越有利于保持蛋白质天然品质。

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Protein and Water Structural Changes in Whiteleg Shrimp （Litopenaeus vannamei） during Frozen Storage as Revealed by Raman Spectroscopy

YUAN Li， JI Xiu， SHI Tong， WANG Yanmin， GAO Ruichang*
（School of Food and Biological Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China）

The mechanism of protein denaturation during frozen storage can be revealed by the interaction between muscle protein and water. In this study， the effect of storage temperature on protein denaturation in whiteleg shrimp （Litopenaeus vannamei） muscle was examined in terms of protein structure and surface water molecules. The secondary structure and deuteration kinetics of whiteleg shrimp muscle protein stored at -18 and -40 ℃ were analyzed by Raman spectroscopy and H/D exchange method. The results showed that the secondary structure of protein molecules changed from tight to loose，suggesting protein unfolding. Furthermore， the structure of protein stored at -18 ℃ was more loose than at -40 ℃. With the unfolding of the protein secondary structure， the surface hydrophobicity of the protein increased， while the interaction between protein and bound water was weakened. The higher the storage temperature was， the more intensely the interaction was weakened， the less stable protein structure was and the more easily moisture loss occurred. In contrast， the lower the frozen temperature was， the stronger the interaction between protein and water was. Consequently， protein structure was more stable. The results showed that lower frozen storage temperature was more effective to maintain protein properties.

whiteleg shrimp （Litopenaeus vannamei）； protein secondary structure； water； frozeng storage；Raman spectroscopy； deuterium

10.7506/spkx1002-6630-201618033

S966

A

1002-6630（2016）18-0202-06

袁丽， 纪秀， 石彤， 等. 拉曼光谱法分析凡纳滨对虾冻藏过程蛋白质与水分结构变化［J］. 食品科学， 2016， 37（18）: 202-207. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618033. http://www.spkx.net.cn

YUAN Li， JI Xiu， SHI Tong， et al. Protein and water structural changes in whiteleg shrimp （Litopenaeus vannamei） during frozen storage as revealed by raman spectroscopy［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 202-207. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618033. http://www.spkx.net.cn

2016-03-17

国家自然科学基金面上项目（31471611；31671882）；江苏大学“青年骨干教师培养工程”项目

袁丽（1978—），女，副教授，硕士，研究方向为食品加工与营养。E-mail：yuanli24@163.com

高瑞昌（1976—），男，教授，博士，研究方向为水产品加工与综合利用。E-mail：xiyuan2008@ujs.edu.cn