黄芪多糖对H2O2所致乳鼠心肌细胞损伤保护作用的研究*

沈玉珏刘津军 陈丁莉 田洪森 苗　毅 陈慧敏 霍燕飞 樊　蔚 温芳华 葛亚肖

（河北省邯郸市中心医院，河北　邯郸056001）

·研究报告·

黄芪多糖对H2O2所致乳鼠心肌细胞损伤保护作用的研究*

沈玉珏△刘津军 陈丁莉 田洪森 苗毅 陈慧敏 霍燕飞 樊蔚 温芳华 葛亚肖

（河北省邯郸市中心医院，河北邯郸056001）

目的观察黄芪多糖（APS）对H2O2所致乳鼠心肌细胞损伤的保护作用机制。方法无菌条件下分离并培养乳鼠心肌细胞72 h后分为空白对照组、H2O2组、APS（20、40和80μmol/L）+H2O2组，每组设10个复孔。给药干预24 h后，观察比较各组细胞形态、细胞存活率、细胞中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性和丙二醛（MDA）含量、培养液中心肌酶（AST、CPK、LDH）活性、细胞凋亡状况及细胞凋亡率情况。结果倒置光学显微镜下，空白对照组呈单层簇状生长，且伪足多而饱满，搏动明显，节律一致；H2O2组细胞胞浆空泡、伪足少，细胞脱落、悬浮、溶解坏死，搏动弱且频率低、节律不齐等；APS各治疗组与H2O2组比较，心肌细胞形态不同程度好转，且以APS（80μmol/L）+H2O2组改善效果最明显。H2O2组心肌细胞存活率与空白对照组比较降低（P＜0.01）；APS（40、80μmol/L）+H2O2组细胞存活率与H2O2组比较升高（P＜0.01）。H2O2组乳鼠心肌细胞SOD、GSH-Px、CAT活性与空白对照组比较降低，MDA含量则升高（P＜0.01）；APS（40、80μmol/L）+H2O2组SOD、GSH-Px、CAT活性与H2O2组比较均升高（P＜0.05或P＜0.01），MDA含量则降低（P＜0.01）。H2O2组乳鼠心肌细胞培养液中AST、CPK、LDH活性与空白对照组比较均升高（均P＜0.01）。APS（40、80μmol/L）+H2O2组AST、CPK、LDH活性与H2O2组比较均降低（均P＜0.05或P＜0.01）。Flow Cytometry检测空白对照组仅存在少量凋亡细胞，H2O2组凋亡细胞数量较空白对照组增多；与H2O2干预组比较，APS干预24 h可明显改善H2O2诱导损伤乳鼠心肌细胞凋亡状况，其以APS（80μmol/L）+H2O2组效果最明显。H2O2组乳鼠心肌细胞凋亡率与空白对照组比较升高（P＜0.01）；APS（40、80μmol/L）+H2O2组细胞凋亡率与H2O2组比较则降低（P＜0.01）。结论APS可通过有效改善细胞生存状态、提高细胞存活率、降低氧化应激损伤、抑制细胞凋亡而发挥对H2O2乳鼠心肌细胞损伤的保护作用。

黄芪多糖H2O2心肌细胞保护

【Abstract】Objective：To investigate the protective effects of Astraglus Polysaccharides on neonatal rat cadiocytes impared by H2O2.Methods：Cadiocytes of neonate rat was cultivated for 72 hours and divided into six groups：normal control group，H2O2group，APS（20，40，80μmol/L）+H2O2groups（n=10）.Twelve hours after the drugs were given，the morphology changes was observed；the survival rate was detected by MTT；the activity of SOD，GSH-Px，CAT and the content of MDA in cardiomyocytes were determinted；the activity of AST，CPK，LDH in culturemedium were detected；the cardiomyocytes apoptosis was observed by flow cytometry and the apoptosis rate was calculated.Results：Compared with H2O2group，themorphology of neonatal rat cadiocytes in APSgroups were significantly improved；the survival rate in APS（40，80μmol/L）+H2O2groupswere significantly increased；the activity of SOD，GSH-Px，CAT in cardiomyocytes were significantly increased and the content of MDA were significantly decreased；the activity of AST，CPK，LDH in culture medium were significantly decreased；the cardiomyocytes apoptosiswere improved and the apoptosis rate were significantly decreased，all of the difference were significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：APS can effectively improve neonatal rat cadiocytesmorphology，improve the activity of antioxidase and depress oxidative stress，improve the survival rate and decrease the apoptosis rate，suggesting that APShad protective effects on neonatal rat cadiocytes impared by H2O2.

【Key words】Astraglus Polysaccharides；H2O2；Cardiomyocytes；Protection黄芪为我国传统中药之一，首见于《神农本草经》，其味甘性微温，可益气补虚。现代药学研究发现，黄芪多糖（APS）是中药黄芪的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤等多种作用［1-3］。本研究观察采用APS干预H2O2所致乳鼠心肌细胞损伤获得了较好保护效果。现报告如下。

1　材料与方法

1.1药物与试剂黄芪多糖由西安沃森生物科技有限公司提供（批号20131205）；DMEM培养基、胎牛血清，由美国Gibco公司提供；二甲基亚砜（DMSO）、甲基四唑蓝（MTT）由美国Sigma公司提供；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）试剂盒，由北京博奥森生物技术有限公司提供；谷草转氨酶（AST）、磷酸肌酸激酶（CPK）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司提供；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒，由碧云天生物技术有限公司提供。

1.2动物清洁级雄性SD 1～3 d乳鼠［4］，由河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK（冀）2008-1-003，合格证号：150513004。

1.3主要仪器SW-4T-2F洁净工作台，由上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产；NU-4850E型CO2培养箱，美国Nu Aire公司生产；VCX750型超声波细胞破碎仪，由美国SONICS公司生产；UV762型紫外-可见分光光度计，由上海楚定分析仪器有限公司生产；BS-300型全自动生化分析仪，由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产；iMark型酶标仪、FACSAria型流式细胞仪，由美国BD公司生产。

1.4乳鼠心肌细胞分离、培养与分组［4］无菌环境下乳鼠开胸剪取心室组织，剪碎、加0.1%胰酶于37℃6 min振荡消化，去上清、沉淀，0.1%胰酶继续于37℃6min振荡消化，如此反复至组织碎块完全消化，收集消化上清液，1500 r/min离心10 min，取沉淀，加入心肌细胞培养基（10%胎牛血清DMEM，内含105U/L的青霉素和链霉素），吹打均匀，壁立1.5 h。收集未贴壁细胞，调整细胞至6×108个/L，接种于35 mm培养皿中（37℃、5%CO2、湿度100%），培养72 h，将状态良好的原代乳鼠心肌细胞随机分为：空白对照组、H2O2（200μmol/L）组、APS（20、40、80μmol/L）+ H2O2（200μmol/L）组，每组设10个复孔；经药物干预24 h后，检测各指标。

1.5观察指标1）细胞形态：药物干预24 h后弃培养液，经PBS溶液冲洗2次后，去离子水洗涤至显微镜下细胞间隙清晰止，晾干、倒置光学显微镜下观察细胞形态并拍照保存。2）细胞存活率：参照王知斌等［5］报道的实验方法测定，药物干预24 h后，将细胞接种于96孔培养板（n=6），每孔加20μLMTT溶液（5 mg/mL），37℃孵育4 h后弃上清，每孔加150μL二甲基亚砜（DMSO），振荡15min，酶标仪490 nm处检测OD值，计算其细胞存活率。细胞存活率（%）=（实验组OD值/空白对照组OD值）×100%。3）细胞中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量：药物干预24h后弃培养基，每孔加入2 mL PBS溶液、冰浴中破碎处理30 s，低温离心取上清，紫外-可见分光光度计测定各组SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。4）培养液中AST、CPK、LDH活性：药物干预24 h后，分别取各组培养液并按各自试剂盒方法操作，全自动生化分析仪测定各组细胞AST、CPK、LDH活性。5）细胞凋亡及细胞凋亡率：药物干预24 h后，0.25%胰酶进行消化，离心弃上清，PBS液冲洗2次，严格按AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒操作处理，避光孵育10 min后行Flow Cytometry检测，观察各组细胞凋亡状况；计算凋亡率，左上象限（Q1）表示碎片或损伤细胞，左下象限（Q3）表示正常细胞，右上象限（Q2）表示凋亡晚期细胞或坏死细胞，右下象限（Q4）表示早期凋亡细胞。

1.6统计学处理应用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（表示，组间比较采用单因素方差分析。计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组乳鼠心肌细胞形态比较见图1。倒置光学显微镜结果示，空白对照组呈单层簇状生长，且伪足多而饱满，搏动明显，节律一致；H2O2组细胞胞浆空泡、伪足少，细胞脱落、悬浮、溶解坏死，搏动弱且频率低、节律不齐等；APS各治疗组与H2O2组比较，心肌细胞形态不同程度好转，且以APS（80μmol/L）+H2O2组改善效果最明显。

图1　各组乳鼠心肌细胞形态的比较

2.2各组乳鼠心肌细胞存活率比较见表1。MTT法检测结果示，H2O2组心肌细胞存活率与空白对照组比较降低（P＜0.01）；APS（40、80μmol/L）+H2O2组细胞存活率与H2O2组比较升高（P＜0.01）。

表1　各组乳鼠心肌细胞存活率比较（

表1　各组乳鼠心肌细胞存活率比较（

与H2O2组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别n空白对照组10 H2O2组10 APS（20μmol/L）+H2O2组10存活率（%）97.4±4.7 43.5±6.3△△49.0±7.2 APS（40μmol/L）+H2O2组10 67.1±9.3**APS（80μmol/L）+H2O2组10 83.5±11.7**

2.3各组乳鼠心肌细胞SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量比较见表2。结果示，H2O2组乳鼠心肌细胞SOD、GSH-Px、CAT活性与空白对照组比较降低，MDA含量则升高（P＜0.01）；APS（40、80μmol/L）+H2O2组SOD、GSH-Px、CAT活性与H2O2组比较均升高（P＜0.05或P＜0.01），MDA含量则降低（P＜0.01）。

表2　各组乳鼠心肌细胞SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量比较（

表2　各组乳鼠心肌细胞SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量比较（

组别n空白对照组10 H2O2组10 APS（20μmol/L）+H2O2组10 APS（40μmol/L）+H2O2组10 APS（80μmol/L）+H2O2组10 SOD（U/mg）CAT（U/mg）GSH-Px（U/mg）MDA（nmoL/mg）109.5±16.4 32.0±6.3 3.76±0.95 6.24±1.38 65.7±13.2△△18.7±4.5△△1.88±0.74△△11.27±2.04△△70.9±15.1 20.8±5.3 2.07±0.76 9.03±1.81 84.2±16.8*25.7±6.4**2.43±0.82*8.42±1.65**100.7±19.5**28.5±7.0**2.61±0.85*6.73±1.49**

2.3各组乳鼠心肌细胞培养液中AST、CPK、LDH活性比较见表3。结果示，H2O2组乳鼠心肌细胞培养液中AST、CPK、LDH活性与空白对照组比较均升高（均P＜0.01）。APS（40、80μmol/L）+H2O2组AST、CPK、LDH活性与H2O2组比较均降低（均P＜0.05或P＜0.01）。2.4各组乳鼠心肌细胞凋亡情况比较见图2，表4。结果示，Flow Cytometry检测空白对照组仅存在少量凋亡细胞，H2O2组凋亡细胞数量较空白对照组增多；与H2O2干预组比较，APS干预24 h可明显改善H2O2诱导损伤乳鼠心肌细胞凋亡状况，其以APS（80μmol/L）+H2O2组效果最明显。H2O2组乳鼠心肌细胞凋亡率与空白对照组比较升高（P＜0.01）；APS（40、80μmol/L）+ H2O2组细胞凋亡率与H2O2组比较则降低（P＜0.01）。

表3　各组乳鼠心肌细胞培养液中AST、CPK、LDH活性比较（

表3　各组乳鼠心肌细胞培养液中AST、CPK、LDH活性比较（

组别n空白对照组10 H2O2组10 APS（20μmol/L）+H2O2组10 APS（40μmol/L）+H2O2组10 APS（80μmol/L）+H2O2组10 AST（U/mL）CPK（U/mL）LDH（U/L）21.8±3.6 1.42±0.35 530.7±64.9 34.1±6.2△△2.67±0.58△△925.4±127.3△△30.5±5.8 2.43±0.60 871.6±115.3 26.4±5.1*1.91±0.45**773.5±96.1*23.7±4.3**1.64±0.42**645.9±82.4**

图2　各组乳鼠心肌细胞凋亡比较

表4　各组乳鼠心肌细胞凋亡率比较（

表4　各组乳鼠心肌细胞凋亡率比较（

组别n空白对照组10 H2O2组10 APS（20μmol/L）+H2O2组10凋亡率（%）4.4±1.8 53.6±8.3△△47.5±7.7 APS（40μmol/L）+H2O2组10 34.9±6.1**APS（80μmol/L）+H2O2组10 16.3±4.2**

3　讨　论

冠状动脉粥样硬化性心脏病及其所诱发的急性心肌梗死严重危害人类的生命健康，目前其治疗主要通过溶栓、介入手术等措施及时恢复血供，可极大地缓解缺血症状并降低死亡率，但“再灌注损伤”并发症的存在严重影响着患者愈后。近年来研究发现，再灌后伴随氧的大量进入、氧自由基大量生成并过剩而诱发广泛的氧化应激损伤及继发细胞凋亡，是缺血再灌注损伤发生发展的重要机制［5-6］。

正常状态下，体内氧自由基（ROS）的生成与清除处于动态平衡。在ROS的还原清除过程中有多种抗氧化酶参与，其中SOD被称为体内防御ROS损伤的第一道屏障，其可提供氢原子配体而催化还原ROS生成H2O2，并在GSH-Px或CAT的进一步催化下生成对人无害的H2O和O2［7-8］，所以SOD、GSH-Px、CAT的活性能够直接反映机体抗氧化能力；MDA为脂质过氧化最终产物，其含量可间接反映心肌细胞损伤程度。正常状态下，血清中心肌酶含量极低，但当细胞膜受氧自由基攻击受损后可导致细胞中心肌酶（AST、CPK、LDH）等迅速释放入血而致血清中AST、CPK、LDH活性突然增高，因此血清AST、CPK、LDH的活性水平可敏感反映心肌细胞受损的程度。细胞凋亡是一种有多种基因参与调控的程序化死亡过程，陈良金等研究发现氧化应激损伤是细胞凋亡最重要的诱发因素之一［9-15］。

本研究结果示，与空白对照组比较，经APS干预24 h可有效提高H2O2诱导损伤乳鼠心肌细胞存活率，改善SOD、GSH-Px、CAT活性，降低MDA含量和培养液中AST、CPK、LDH活性，抑制细胞凋亡，表明APS可保护H2O2诱导损伤乳鼠心肌细胞，其机制可能与APS能有效改善抗氧化酶活性、降低氧化应激损伤有关。

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Protective effects of Astraglus Polysaccharides on Neonatal Rat Cadiocytes Impared by H2O2

SHEN Yujue，LIU Jinjun，CHEN Dingli，etal.Handan Central Hospital，Hebei Province，Hebei，Handan 056001，China

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1675-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.009

2016-03-30）

河北省卫生厅重点科技研究计划（20130359）

（电子邮箱：zhjkhg@163.com）