大肠杆菌表达的重组新蛭素的生产工艺

吴祖泽，郭莹莹，刘玉斌，郭彦梅，董俏言，靳继德，姚 敏，于爱平

（1.北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京 100024；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850）

大肠杆菌表达的重组新蛭素的生产工艺

吴祖泽1，2，郭莹莹1，2，刘玉斌2，郭彦梅2，董俏言2，靳继德2，姚 敏2，于爱平2

（1.北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京 100024；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850）

为建立可产业化的大肠杆菌表达的重组新蛭素（neorudin，EH）生产工艺，主要采取从低密度到高密度发酵的优化思路，优化了发酵罐培养基和诱导时间；比较了超声破碎和反复冻融的目的蛋白提取方法；纯化工艺采用离子交换层析2步法进行:SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析和Source 15Q阴离子交换层析；所得产品用免疫印迹法鉴定，经HPLC检测纯度，凝块法检测抗凝比活性；最后对纯化产品进行结构确证，包括高分辨率质谱、C-末端测序、N-末端测序、二硫键分析.结果显示:优化后的发酵工艺确定基于TB培养基的高密度发酵工艺，菌体OD600可达40左右，每升菌体湿质量可达70 g左右，目的蛋白表达量约400 mg/L；菌体反复冻融离心上清经过纯化获得的目的蛋白HPLC纯度均大于97%，纯化收率为26.12%，抗凝比活性为1 024 ATU/mg，用高分辨率质谱检测其分子质量约为7 415.188 0 ku，N-末端、C-末端和二硫键均与理论相符.建立了EH在大肠杆菌中的高密度发酵和纯化工艺.

新蛭素；大肠杆菌；高密度发酵；离子交换层析；抗凝活性

血栓性疾病是当今社会最重要的致残和致死性疾病之一，主要包括动脉血栓及静脉血栓等，血栓形成是其重要诱因，抗凝药物是预防和治疗该类疾病的重要手段.目前临床上最常用的抗凝药物主要有华法林和肝素类.这2类药的作用机制复杂，且肝素类药还有引起血小板减少的副作用［1-2］.水蛭素是凝血酶的特异抑制剂，水蛭素与凝血酶结合后，使凝血酶失去裂解纤维蛋白原为纤维蛋白的能力，阻止纤维蛋白的凝固，从而抑制血栓的形成［3］.但是，水蛭素在使用过程中也会出现一些出血副作用［4］，为了降低水蛭素的出血副作用，本实验室将可被凝血因子Xa（FXa）或XIa（FXIa）特异识别并切割的短肽:谷氨酸-脯氨酸-精氨酸（EPR）［5］连接至水蛭素的N-末端而构成新蛭素（neorudin，EH），EPR封闭了水蛭素的抗凝活性，使EH只有在血栓局部才会被凝血因子Xa或XIa裂解，释放其抗凝活性，达到靶向抗栓的作用，从而降低全身出血的风险［6-7］.

本实验室前期研究结果显示:EH在多种血栓形成模型动物体内能发挥确切的抗栓作用，安全性评价结果显示出其出血风险明显低于水蛭素，具有良好的研发前景.但EH目前的生产工艺是在毕赤酵母中表达［8-9］，毕赤酵母发酵周期较长，生产效率相对偏低；本实验室后来采用大肠杆菌作为表达宿主菌，通过摇瓶内表达条件的筛选，实现了EH在大肠杆菌中的可溶性表达［10］.本研究在前期工作基础上，着重研究EH在大肠杆菌重组工程菌的发酵，建立了分离纯化工艺，并对纯化产物进行初步的结构确证和质量分析，以期能适应EH将来的产业化.

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器

40 L发酵罐（德国B.Braun Biotech International公司），AKTA-Purifier（美国GE公司），层析填料SPSepharose Fast Flow、Source 15Q（美国GE公司），高效液相色谱仪（美国 Aglient），C18色谱柱（中国TechMate，4.6 mm.I.D.×250 mm，5 μm，12 nm），电泳仪（美国BIO-RAD公司），紫外分光光度计（美国Thermo公司）.

1.1.2试剂

酵母提取物、蛋白胨（OXOID公司），IPTG （Merck公司），小鼠抗水蛭素单抗（Abcam公司），辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠二抗（Santa Cruz公司），人凝血酶标准品和牛纤维蛋白原（中国食品药品检定研究院），牛凝血因子Xa（BioLabs公司），鲎试剂（厦门市鲎试剂实验厂有限公司），乙腈、甲醇（均为HPLC级，Fisher Scientific公司），其他试剂均为进口或国产分析纯产品.

1.1.3菌种

重组工程菌BL21（DE3）-pET-24-eh由本实验室构建，并保存于-80℃冰箱.

1.1.4培养基

1）摇瓶种子培养基（LB）:蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L.

2）发酵罐培养基（LB）:KH2PO43 g/L，K2HPO46 g/L，（NH4）2SO42 g/L，酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，25%葡萄糖24 mL/L，1 mol/L MgSO44 mL/ L，1 mol/L CaCl20.1 mL/L.

3）LB培养基发酵的流加液:蛋白胨200 g/L，酵母提取物100 g/L，葡萄糖500 g/L，MgSO492 g/L.

4）发酵罐培养基（TB）:KH2PO43 g/L，（NH4）2SO45 g/L，酵母提取物20 g/L，蛋白胨10 g/L，甘油20 mL/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，无水CaCl20.02 g/ L，NH4Cl 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，Na2HPO4·12H2O 6 g/L.

5）TB培养基发酵的流加液:蛋白胨50 g/L，酵母提取物50 g/L，甘油120 mL/L，MgSO4·7H2O 1 g/L.

1.2实验方法

1.2.1一级种子和二级种子培养

分别取冻存菌种0.5 mL接种到2个各装有50 mL LB培养基的1 L三角瓶中，并各加入0.1 mL硫酸卡那霉素（100 mg/mL），37℃，230 r/min培养约12 h，至OD600约为1～2，此为一级种子.将一级种子按0.1%的比例加入2 L LB培养基中，均匀分装在8个1 L三角瓶中，37℃，230 r/min培养约10 h，至OD600约为2～4，此为二级种子.

1.2.2基于LB培养基的低密度发酵

将二级种子液加入到含有19 L LB培养基的发酵罐中，起始培养条件为:37℃培养，200 r/min，通气量为2 L/min，发酵过程中通过调节转速、通气量来维持罐内溶氧值在30%～40%，每隔1 h取样测定OD600，培养至约4 h时开始诱导，IPTG（1 mol/L）终浓度为0.5 mmol/L，诱导时间为4 h.

1.2.3基于LB培养基的高密度发酵

起始培养条件同低密度发酵，培养过程中，通过控制转速、通气量来维持罐内溶氧在30%～40%，转速最高控制在550 r/min，通气量最高控制在15 L/min，培养至约11 h，开始流加LB培养基发酵的流加液，流加速度通过溶氧（溶氧保持在30% ～40%）来反馈控制，待培养约12 h时开始诱导，火焰封口法加入20 mL IPTG（1 mol/L），至终浓度约为1 mmol/L，待菌体OD600不再上升或下降时下罐，发酵过程中用50%的氨水控制pH.

1.2.4基于TB培养基的高密度发酵

起始培养条件同低密度发酵，培养至约5 h时，罐内培养基营养耗尽，开始流加 TB培养基发酵的流加液，培养至约6 h时进行诱导，其余过程同1.2.3（基于LB培养基的高密度发酵）中方法.

在高密度培养的基础上考察诱导时间对于目的蛋白表达量的影响，诱导时间分别为4、5、6、7、8 h. 1.2.5 细菌破碎

破碎细菌有2种方法:1）超声法.将发酵过程中取样所得1 mL发酵液离心，获得菌体加入0.5 mL 50 mmol/L Gly-HCl的缓冲液（pH3.0），置于冰浴中，超声处理程序为:25℃，功率为450 W，超声3 s，停7 s，时间为0.5 h.超声后离心，获得沉淀和上清.2）反复冻融法.下罐发酵液在4℃，4 300 r/min的条件下离心20 min，收集菌体，取菌体与50 mmol/L Gly-HCl的缓冲液（pH3.0）以1∶2的体积比搅拌均匀，用-20℃和室温条件下反复冻融的方法破碎细菌，先经4 300 r/min离心40 min，再经1×104r/min高速离心30 min，收集上清，-20℃保存备用.

1.2.6离子交换层析

所有操作均在4℃条件下进行，缓冲液A:50 mmol/L Gly-HCl（pH3.0），缓冲液 B:A+1 mol/L NaCl；冻融所得上清以8 mL/min上预先用缓冲液A平衡好的 SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱（5 cm×12 cm），上样结束后，以12 mL/min流速进行洗脱，洗脱程序设为:缓冲液A洗2个柱体积（CV）→ 0～10%B 1CV→ 10% ～35%B 6CV→35%～100%B 3CV.检测波长为280 nm.收集各洗脱峰，SDS-PAGE和Lowry法检测目的蛋白峰及其蛋白浓度，保存于-20℃备用.

准备Source 15Q阴离子交换层析所用缓冲液，缓冲液A:20 mmol/L的L-His（pH6.0），缓冲液B:A+ 1 mol/L NaCl；将阳离子交换层析收集得到的EH洗脱峰用缓冲液A稀释5倍，然后将稀释的样品以8 mL/min流速上预先用缓冲液A平衡过的 Source 15Q阴离子交换柱（5 cm×9.5 cm），上样结束后，以10 mL/min流速进行洗脱，洗脱程序设置为:缓冲液A 2CV→0～15%B 1CV→15%～25%B 5CV→25%～100%B2CV.检测波长为280 nm.收集各洗脱峰后测其蛋白含量和抗凝活性，将目的峰收到无热源的容器中，冻于-20℃冰箱中.

1.2.7抗凝活性测定

将纯化后样品加生理盐水稀释成1 mg/mL，取稀释后的EH供试品溶液30 μL，加入1 μL的牛源凝血因子Xa轻混匀，37℃水浴6 h，取裂解后样品用去离子水做2倍倍比稀释.依次取不同稀释度的样品各10 μL至Epprndorf管中；各加入8 IU/mL的凝血酶20 μL，轻混匀后分别再加入5 mg/mL的纤维蛋白原20 μL，轻弹混匀，加第一个样后开始计时；室温静置15 min，观察凝块形成情况.以同体积去离子水代替裂解的EH溶液和凝血酶溶液，其他条件不变作为空白对照；以同体积去离子水代替裂解的EH溶液，其他条件不变作阳性对照；以未经裂解的EH样品其他条件不变作为裂解前对照.抗凝比活性计算公式为:抗凝比活性=无凝块出现的最大稀释倍数×16 ATU/mg.

1.2.8SDS-PAGE

16.5%的分离胶，5%的浓缩胶，上样量20 μL，恒压70 V条件下开始电泳，进入分离胶后将电压调至130 V，电泳结束后，考马斯亮蓝染色.

1.2.9高效液相色谱（HPLC）

采用TechMate C18色谱柱，流动相A:H2O+ 0.1%三氟乙酸，流动相B:乙腈+0.1%三氟乙酸，洗脱梯度为:在0～40 min时B相由5%增加至95%，洗脱速度为1 mL/min.检测波长为214 nm.

1.2.10免疫印记法

SDS-PAGE电泳结束后，使用半干转移法将蛋白从凝胶中转移到PVDF膜上，恒压15 V，转移20 min，转移完成后，将PVDF膜放入封闭液（10%脱脂奶粉的TBST）中，室温摇床封闭2 h；封闭结束后，将PVDF膜放入含鼠水蛭素抗体（1∶1 000）的封闭液中，室温摇床孵育2 h，用TBST洗涤6次，每次5 min；取出PVDF膜，放入含羊抗鼠抗体（1∶5 000）的封闭液中，室温摇床孵育1 h，用TBST洗涤6次，每次5 min；ECL显色.

蛋白含量采用Lowry法测定，按照《中国药典》2010版三部进行［11］.

1.2.12鲎试剂检测细菌内毒素

采用凝胶法检测纯化所得的目的蛋白内毒素含量，具体参照《中国药典》2010年版三部［11］.

1.2.13结构确证

取纯度＞95%的EH样品，进行精确质谱、C-末端、N-末端以及二硫键分析:

1）用TripeTOFTM5600+质谱仪（AB SCIEX）进行质谱分析；分析时长:35 min，检测方式:正离子，母离子扫描范围:350～4 000 m/s.

2）用Trypsin酶解样品，酶解后的肽段通过高效液相色谱进行分离，再通过TripleTOF 5600+进行测试.经过LCMSMS分析后，得到MS2图谱，与理论C端序列进行比对.

倒装是将语句中的主语、谓语、宾语、状语等颠倒顺序的一种语法现象，常常具有强调语气。常见的英语中的倒装有全部倒装和部分倒装。作者在本文中都有使用,请看下列例句.

3）采用Edman降解法处理样品，依次生成各种PTH-AA，经液相系统色谱柱分离确定被测蛋白质供试品N端的氨基酸排列顺序.

4）样品用TripleTOFTM5600+质谱仪进行检测扫描质谱分析.先计算二硫键所在肽段在还原前后的一级质谱数据，再由人工匹配验证肽段二级质谱，最后确定二硫键的连接方式.

以上分析由上海中科新生命蛋白质组学研究分析中心完成.

2　结果

2.1工程菌的发酵

2.1.1基于LB培养基的低密度发酵

该条件下，菌体生长曲线如图1所示，下罐时OD600为7.2，离心得菌体湿质量为324 g，从电泳图（图2）中可以看出，工程菌在超声后目的蛋白集中在上清中，而菌体中几乎没有目的蛋白.

2.1.2基于LB培养基的高密度发酵

LB培养基条件下的高密度发酵生长曲线如图3（a）所示，培养至约11 h时开始流加LB培养基发酵的流加液，总培养时间为20.5 h，下罐时，菌体OD600为22.8，离心得菌体湿质量为848 g.菌体通过超声获得目的蛋白的电泳结果见图3（b）.

2.1.3基于TB培养基的高密度发酵

图4为TB培养基培养的菌体高密度发酵生长曲线，培养至约5 h时开始流加TB培养基发酵的流加液，直至下罐，下罐时OD600为42，离心得到菌体湿质量为1 319 g.显区别，因此为节约时间，确定诱导时间为4 h.

图5为反复冻融法获得目的蛋白的电泳结果，诱导时间为4、5、6、7、8 h的目的蛋白表达量并无明

摇瓶种子培养基为LB培养基，罐内培养基为TB培养基，37℃培养，诱导时间为4 h，按上述生产条件重复3批，发酵液的OD600、菌体湿质量以及目的蛋白的表达量基本稳定，具体见表1.

表1　3批工程菌发酵结果Table 1 Expression of EH protein after fermentation

2.2分离纯化

高速离心后，菌体反复冻融上清上阳离子交换层析，目的峰为峰3，从电泳图中可以看出，具体结果见图6.收集到的目的蛋白峰再上阴离子交换层析，目的峰为峰2，具体结果如图7所示.

经过2步离子交换层析获得目的蛋白69.6 mg，整个纯化过程目的蛋白回收率见表2.

2.3HPLC检测纯度

将纯化所得样品经高效液相色谱（见图8）分析，按面积归一化法计算，EH纯度为97.84%.

2.4免疫印迹法

2步纯化后得到的EH蛋白纯品，其免疫印迹法结果见图9.

2.5凝块法检测蛋白抗凝比活性

纯化所得EH样品，经过抗凝活性检测，裂解后的EH稀释至128倍时出现凝块，没有裂解的EH不具备抗凝活性，结果见表3.计算EH的抗凝比活性为1 024 ATU/mg.

表2　EH的纯化数据Table 2 Purification parameters of EH

2.6结构确证

1）高分辨质谱法测定EH分子质量为7415.1880ku，与理论值7 415.271 5 ku相近.

2）C-末端测定序列为 Phe-Glu-Ser-His-Asn-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln，与EH理论序列一致.

3）N-末端测定序列为Met-Glu-Pro-Arg-Ile-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn，与理论序列一致.

4）二硫键分析显示有6个半胱氨酸，3对二硫键，连接方式为:Cys9-Cys17、Cys19-Cys31、Cys25-Cys42，与理论序列一致.

表3　EH的抗凝比活性Table 3 Specific anti-coagulation activity of EH protein

2.7鲎试剂检测目的蛋白的细菌内毒素

纯化所得的EH样品经鲎试剂检测，内毒素含量小于0.5 EU/mg.

3　讨论

大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，培养条件简单，发酵周期短，目前大肠杆菌是应用最广泛、最成功的表达体系之一，常作高效表达的首选体系［12］.

本实验室首次将采用大肠杆菌作为EH的表达载体，发酵工艺从低密度发酵优化到高密度发酵，提高了发酵菌体的密度和EH的产量.低密度发酵证明了EH在大肠杆菌重组工程菌中实现了可溶性表达，避免了大肠杆菌表达常见的包涵体问题，从而在获取蛋白方面免去了变性复性等复杂的工艺.高密度发酵实现了发酵条件的优化，即从LB培养基到TB培养基的优化，在用LB培养基培养工程菌时，生长速率缓慢且出现了溶菌现象，分析原因可能是因为LB培养基以葡萄糖为碳源，产生的乙酸会抑制工程菌的生长，不利于高密度发酵.而TB培养基以甘油为碳源，有文献报道［13］，以甘油为碳源可以降低乙酸的产生，而在发酵过程中，使用TB培养基确实降低了溶菌的现象.生长效率方面，LB培养基培养时间一般约20 h，菌体OD600在20左右，而TB培养基培养工程菌时间约11 h，菌体OD600在40左右，生产效率提高了近一倍，更适于高密度发酵.在TB培养基高密度发酵的基础上对其诱导时间进行优化，并确定诱导时间为4 h，从而节约了大量的人力物力.

分离纯化方面，由于EH在大肠杆菌中呈现可溶性表达，相比较超声破碎法，反复冻融法可以避免许多杂蛋白的干扰，因此在生产过程中，选择反复冻融法来获取目的蛋白；当EH在毕赤酵母中表达时，因毕赤酵母是分泌型表达，目的蛋白是分布在上清中，上清要经过2步超滤浓缩，才能上层析柱，而反复冻融出来的样品，仅需要2步离心，从而节约了仪器设备，简化了实验过程.分离过程中，阳离子交换层析线性洗脱方式，洗脱速度快，分离效果较好，再经过缓冲液稀释上Source15Q阴离子交换层析，得到的目的蛋白经测定，纯度达到97%以上，收率为72.53%.

纯化获得的样品采用凝块法检测其抗凝活性，以确定所得EH在正常情况下不具备抗凝活性，只有在被FXa裂解后才会发挥其抗凝作用；同时用鲎试剂检测其细菌内毒素，检测结果小于0.5 EU/mg；在此基础上对EH纯品进行结构确证，包括高分辨质谱、C-末端、N-末端测序以及二硫键的分析，结果显示EH的分子量及结构与理论序列一致.

4　结论

综上所述，本研究建立的生产工艺可以获得结构、纯度和活性合格的EH产品，且能节省仪器设备、原材料等成本，减少了中间环节，重复性良好，易于放大，适合于大规模生产EH.

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（责任编辑 张 蕾）

Production Technology of Recombinant Neorudin Expressed in E.coli

WU Zuze1，2，GUO Yingying1，2，LIU Yubin2，GUO Yanmei2，DONG Qiaoyan2，JIN Jide2，YAO Min2，YU Aiping2
（1.College of Life Science and Bioengineering，Beijing University of Technology，Beijing 100024，China；
2.Department of Experimental Hematology，Beijing Institute of Radiation Medicine，Beijing 100850，China）

To establish an industrial method of recombinant neorudin（EH）expressed in Escherichia coli，low density fermentation and high density fermentation were performed in this study，and in the high density fermentation，the fermentation culture medium and the induction time were investigated. Sonication and repeated freezing and thawing method were carried out to evaluate the release of EH from E.coli.SP Sepharose Fast Flow cation exchange chromatography and Source 15Q antion exchange chromatography were chosen to purify EH.The purified protein was identified by Western blot，its purity was analyzed by HPLC，and the special anticoagulant activity was detected by a clot method.Finally the purified protein was confirmed with the high resolution mass spectrum，C-terminal amino acid sequence analysis，N-terminal amino acid sequence analysis and disulfide bond analysis.The result shows that the high density fermentation based on TB culture medium is established.OD600was about 40 after fermentation，the wet weight of cell was about 70 g/L，and the expression level of EH was about 400 mg/ L.Compared with sonication，repeated freezing and thawing method ensured EH release with lessirrelevant proteins.After a two-step ion-exchange chromatography，the purity of EH analyzed by HPLC was 97.84%.The special anticoagulant activity of EH protein was about 1 024 ATU/mg after incubation with bovine coagulation factor Xa.Furthermore，the molecular weight of EH was determined to be 7 415.188 0 ku by high resolution mass spectrum.The results of C-terminal amino acid sequence analysis，N-terminal amino acid sequence analysis and disulfide bond analysis show that the EH protein produced with the production methods is right.A fermentation and purification method of EH expressed in E.Coli is developed.

neorudin；Escherichia coli；high density fermentation；ion-exchange chromatography；anticoagulant activity

Q 819

A

0254-0037（2016）02-0302-07

10.11936/bjutxb2015040011

2015-04-06

国家科技重大专项资助项目（2012ZX09102301-008）

吴祖泽（1935—），男，研究员，主要从事实验血液学方面的研究，E-mai:wuct@nic.bmi.am.cn

于爱平（1972—），女，副研究员，主要从事实验血液学方面的研究，E-mai:yuap117@163.com