膜联蛋白Ⅱ在胃癌组织中的表达及其在胃癌转移中的作用

韩峰　黄华　吕黄勇　聂川　林玲解放军第五十九中心医院消化内科，云南　开远　66600昆明医科大学第二附属医院消化内科，昆明　650000

膜联蛋白Ⅱ在胃癌组织中的表达及其在胃癌转移中的作用

韩峰1黄华2#吕黄勇1聂川1林玲1
1解放军第五十九中心医院消化内科，云南开远661600
2昆明医科大学第二附属医院消化内科，昆明650000

目的探讨膜联蛋白Ⅱ（AnnexinⅡ）在胃癌组织中的表达及其在胃癌转移中的作用。方法采用免疫组织化学法检测AnnexinⅡ在51例胃癌组织和24例癌旁组织中的表达，并统计AnnexinⅡ阳性表达与胃癌患者临床特征的关系。用AnnexinⅡ特异性siRNA在胃癌HGC-27细胞抑制AnnexinⅡ的表达，应用黏附实验、侵袭实验检测抑制AnnexinⅡ表达后对胃癌细胞的黏附、侵袭能力的影响。结果AnnexinⅡ蛋白在胃癌组织中阳性率为82.4%，在癌旁组织中阳性率为37.5%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；并且AnnexinⅡ阳性表达与患者的性别与年龄无关（P＞0.05），而与肿瘤大小、组织分化程度、临床分期、淋巴结转移临床特征有关，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在胃癌HGC-27细胞转染AnnexinⅡsiRNA后，细胞中AnnexinⅡ的蛋白和mRNA水平均下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。并且抑制AnnexinⅡ表达后，胃癌HGC-27细胞的黏附、侵袭能力下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论AnnexinⅡ在胃癌组织中高表达，AnnexinⅡ蛋白表达与肿瘤大小、组织分化程度、临床分期、淋巴结转移临床特征有关，并且AnnexinⅡ高表达可促进胃癌转移。因此，AnnexinⅡ可以作为抑制胃癌转移的潜在靶点，开发靶向AnnexinⅡ的药物可能成为治疗胃癌转移的新方法。

胃癌；AnnexinⅡ；转移

Oncol Prog，2016，14（7）

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在消化道恶性肿瘤中居首位，在世界范围内也具有较高的发病率和病死率。由于其症状隐匿，病情发展较快，诊断时多为中晚期，治疗效果往往较差，严重威胁人类健康。但早期胃癌的治疗效果好，行根治术后5年生存率可达90%以上，因此深入研究胃癌的发生发展机制，对于早期诊断胃癌及指导胃癌的治疗有着十分重要的临床意义。膜联蛋白Ⅱ（AnnexinⅡ）是一种钙离子依赖性的磷脂结合蛋白，主要以单体、二聚体及四聚体形式存在，研究显示，AnnexinⅡ在肝癌、乳腺癌、肠癌等多种恶性肿瘤中均有高表达，并在肿瘤的发生、发展、浸润转移过程中发挥重要的作用。本研究通过采用免疫组织化学法检测AnnexinⅡ在51例胃癌组织和24例癌旁组织中的表达，统计AnnexinⅡ阳性表达与胃癌患者临床特征的关系。并用AnnexinⅡ特异性siRNA在胃癌HGC-27细胞抑制AnnexinⅡ的表达，检测细胞黏附、侵袭能力的变化。现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1材料

收集解放军第五十九中心医院2012年1月至2014年12月手术切除胃癌标本51例，51例胃癌组织标本中27例取自2012年1月至2013年10月胃癌术后制作好的蜡块组织，没有癌旁组织标本。其中男30例，女21例；年龄32～78岁，平均年龄58.6岁；病理分级：低分化36例，高分化15例；TNM分期：Ⅰ期0例，Ⅱ期17例，Ⅲ期26例，Ⅳ期8例（患者出现明显的消化道出血且内科治疗效果差或出现消化道梗阻，患者及其家属要求行减瘤手术姑息治疗）。以上病例术前均未作放疗、化疗等抗肿瘤治疗。从以上51例胃癌患者的胃正常切缘组织中随机抽取24例作为对照组。所有标本用甲醛固定，石蜡包埋，切片。胃癌HGC-27细胞购自上海生化与细胞生物学研究所细胞库。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学法染色AnnexinⅡ抗体购自Abcam试剂公司；免疫组化检测试剂盒、DAB试剂盒购自碧云天试剂公司。切片进行高温高压组织抗原修复。染色步骤按试剂盒说明书进行，用已知阳性片作阳性对照，用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作阴性对照。结果判断：AnnexinⅡ阳性表达为细胞质中出现棕黄色颗粒状物质。每张切片选择5个具有代表性的高倍视野，每个视野计数约100个细胞，将阳性细胞的百分率和染色强度分别计分。具体判断标准如下：①根据染色程度进行评分，无染色为0分，染色强度弱为1分，中等染色强度为2分，染色强度强为3分。②根据着色细胞百分率进行评分，着色细胞占计数细胞百分率＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。①+②为总积分，总分0～7分。总分0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～5分为阳性（++），6～7分为强阳性（+++）。

1.2.2细胞培养胃癌HGC-27细胞培养于含10%胎牛血清（BSA）的RPMI 1640细胞培养液中，置于5%CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养。

1.2.3细胞转染胃癌HGC-27细胞（1×105/ml）接种于24孔板，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养过夜。无血清培养基洗涤细胞，将1μ（l20 pmol）AnnexinⅡsiRNA溶于49 μl无血清培养基，再将脂质体1 μl溶于59 μl无血清培养基，室温静置10 min后，将两种液体混合，室温静置20 min。然后将混合液加入待转染细胞的24孔板，补加无血清培养基至500 μl，置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养，6 h后更换为含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基。

1.2.4实时定量PCR用Trizol法提取细胞的总RNA，将提取的细胞总RNA样品反转录成cDNA，用如下反应体系：2 μg模板RNA、1 μl Oligo dT primer、2 μl dNTP mixture、1 μl Ace反转录酶、1 μl RNase inhibitor、4 μl 5×RT buffer，10 μl RNase-free水。反应条件：第一步37℃30 min，第二步84℃30 s。反应产物4℃保存，然后进行实时定量PCR反应。用如下反应体系：12.5 μl RealMasterMix（SYBR I）、2 μl模板cDNA、1 μl正向引物、1 μl反向引物、8.5 μl RNase-free水。反应条件：第一步94℃5 min；第二步94℃60 s、57℃30 s、72℃30 s，共30个循环；第三步72℃5 min；最后4℃结束反应。用实时定量PCR仪的Option Monitor V3.1软件分析实验结果数据。

1.2.5免疫印记实验将生长状态良好的待检测细胞用裂解液冰上裂解，收集裂解液，用BCA蛋白定量试剂盒对细胞裂解液进行总蛋白定量，上样后，进行SDS电泳，转膜后用5%脱脂奶粉封闭，接着加入待检测AnnexinⅡ蛋白的抗体室温孵育2 h，洗膜后加入相应HRP标记二抗。取化学发光检测A液和B液各0.1 ml混匀后，避光滴加至PVDF膜上。将PVDF膜置于Western Blot化学发光检测系统中，曝光适当时间后，进行拍照与定量。

1.2.6细胞黏附实验取0.1 ml的Matrigel胶加入96孔培养板中，4℃预冷过夜。吸出上清液后用含5%BSA的PBS室温封闭30 min，然后用PBS洗2次。细胞计数后用含0.1%BSA的RPMI 1640培养液重悬细胞，以1×105/孔接种于Matrigel胶包被的孔中。37℃培养箱中孵育45 min后，吸出上清培养液和未黏附的细胞，每孔加入0.1 ml含0.2% Cristal viole（t75%乙醇配制）室温染色15 min后，流水冲洗2 min，然后将培养板置于空气中干燥。每孔加入0.1 ml含5%SDS的50%乙醇裂解细胞，静置30 min后，用酶标仪在540 nm波长下检测吸光值。

1.2.7细胞侵袭实验将1∶3稀释的Matrige（lRMPI 1640稀释）加入Matrigel侵袭小室上室，37℃放置2 h，将2×104胃癌细胞分别重悬于0.1%胎牛血清培养液中并接种于小室上室，在小室下室的24孔板内加入含10%胎牛血清的RMPI 1640培养液，37℃培养24 h。取出侵袭小室，用棉签轻轻擦去上室中未穿过的细胞，甲醛固定10 min，苏木精-伊红染色，切下滤膜，中性树胶封片，光镜下计数穿膜的细胞数。光镜下任取10个视野计算穿膜的细胞数。每个独立实验重复3次。

1.3统计学方法

采用SPSS 16-.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1胃癌组织及癌旁组织中AnnexinⅡ的表达

AnnexinⅡ蛋白的阳性表达为细胞质中出现黄色颗粒状物质，主要定位于细胞质中（图1）。在51例胃癌组织中有42例为阳性，其中强阳性3例，阳性12例，弱阳性27例，阴性9例，阳性率为82.4%。在24例癌旁组织中，有9例阳性表达，其中强阳性0例，阳性3例，弱阳性6例，阳性率为37.5%。胃癌组织中AnnexinⅡ蛋白的表达明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P=0.0001）。

图1　免疫组化检测AnnexinⅡ蛋白在胃癌组织和癌旁组织中的表达

2.2AnnexinⅡ蛋白的表达与胃癌患者临床特征的关系

AnnexinⅡ蛋白的阳性表达与患者的性别与年龄无关（P＞0.05），而与肿瘤大小、组织分化程度、临床分期、淋巴结转移临床特征有关，差异具有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

2.3AnnexinⅡ在胃癌转移中的作用

表2　AnnexinⅡ蛋白表达与胃癌患者临床特征的关系

2.3.1siRNA抑制AnnexinⅡ的表达将靶向AnnexinⅡ的siRNA片段（AnnexinⅡsiRNA）转染人胃癌HGC-27细胞，24 h后采用Western Blot和Real Time-PCR检测人胃癌HGC-27细胞中AnnexinⅡ的蛋白表达和mRNA转录的情况，并转染无关干涉siRNA片段（control siRNA）作为阴性对照组。Western Blot结果表明，AnnexinⅡsiRNA可以显著抑制人胃癌HGC-27细胞中AnnexinⅡ的蛋白表达，差异具有统计学意义（t=15.81，P＜0.05），详见图2。Real Time-PCR结果表明，AnnexinⅡsiRNA可以显著抑制人胃癌HGC-27细胞中AnnexinⅡ的mRNA转录，差异具有统计学意义（t=8.04，P＜0.05），详见图3。

图2　AnnexinⅡsiRNA对人胃癌HGC-27细胞中AnnexinⅡ蛋白表达的影响

图3　AnnexinⅡsiRNA对人胃癌HGC-27细胞中AnnexinⅡmRNA转录的影响

2.3.2AnnexinⅡ对胃癌细胞黏附能力的影响为检测AnnexinⅡ对胃癌细胞黏附能力的作用，将胃癌细胞转染AnnexinⅡsiRNA抑制AnnexinⅡ的表达，采用细胞黏附实验检测细胞黏附能力变化。与对照组比较，人胃癌HGC-27细胞转染AnnexinⅡsiRNA后细胞的黏附能力降低，差异具有统计学意义（t=7.02，P＜0.05）。（图4）

图4　AnnexinⅡsiRNA对人胃癌HGC-27细胞黏附能力的影响

2.3.3AnnexinⅡ对胃癌细胞侵袭能力的影响为检测AnnexinⅡ对胃癌细胞侵袭能力的作用，将胃癌细胞转染AnnexinⅡsiRNA抑制AnnexinⅡ的表达，采用细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力变化。与对照组比较，人胃癌HGC-27细胞转染AnnexinⅡsiRNA后细胞的侵袭能力降低，差异具有统计学意义（t=7.82，P＜0.05）。（图5、图6）

图5　AnnexinⅡsiRNA对人胃癌HGC-27细胞侵袭能力的影响

图6　统计学分析AnnexinⅡsiRNA对人胃癌HGC-27细胞侵袭率的影响

3　讨论

膜联蛋白（Annexin，ANX）是一类钙离子依赖性的磷脂结合蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞质或细胞外基质中，在结构上均具有两个基本的功能结构域：高度保守的C末端核心区和高度可变的N末端结构域，前者具有Ca2+与膜的结合位点，以钙离子依赖的方式可逆的与细胞膜磷脂结合，后者决定了Annexin特异的生物学功能。Annexin参与细胞的一系列活动，如胞吞、胞吐、细胞增殖、分化和凋亡、细胞骨架活动及信号转导等。AnnexinⅡ作为Annexin家族A亚家族的一员，又名p36、AXA2、LIP2等，其基因位于15q21～q22，含1.4 kb编码基因，蛋白分子量为36 kD，其具有RNA结合的特性，除在细胞分泌、增殖、细胞骨架连接及纤溶等方面发挥作用外，还可以结合到C-myc mRNA上，可上调C-myc蛋白，其表达异常与胃癌发生、发展关系密切，如介导凋亡、诱导分化等［4-6］。

本研究对胃癌组织、癌旁组织中AnnexinⅡ的表达情况进行了分析，结果显示胃癌组织中AnnexinⅡ蛋白的表达明显高于癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.01），并且发现AnnexinⅡ阳性表达与患者的性别与年龄无关（P＞0.05），而与肿瘤大小、组织分化程度、临床分期、淋巴结转移临床特征有关，差异具有统计学意义（P＜0.05）。以上研究结果提示AnnexinⅡ蛋白与胃癌的恶性程度密切相关。

肿瘤转移是肿瘤最重要的恶性表现，是造成高致死率的直接原因。肿瘤转移需要在肿瘤细胞本身、宿主细胞及细胞外基质之间相互作用下才能完成，涉及一系列复杂过程与步骤，包括肿瘤细胞从原发瘤灶脱离，通过分泌基质金属蛋白酶（MMP）降解细胞外基质进入血管或淋巴管中迁移到远处，再侵袭到继发组织或器官中形成转移灶［7-11］。因此研究肿瘤转移对于临床诊治有重要意义。为明确AnnexinⅡ是否在胃癌转移过程中发挥作用，我们对胃癌HGC-27细胞应用AnnexinⅡ特异性siRNA抑制AnnexinⅡ的表达，研究在AnnexinⅡ的表达降低后，胃癌HGC-27细胞的转移能力，包括黏附、侵袭能力的变化。在研究中发现，在胃癌HGC-27细胞中应用AnnexinⅡ特异性siRNA抑制AnnexinⅡ的表达后，胃癌细胞的黏附、侵袭能力均降低，提示AnnexinⅡ在胃癌转移过程中发挥了重要的作用。

综上所述，AnnexinⅡ在胃癌组织中呈现高表达，并与胃癌组织分化程度、临床分期、淋巴结转移临床特征有关，应用AnnexinⅡ特异性siRNA在胃癌HGC-27细胞抑制AnnexinⅡ的表达后，胃癌细胞黏附、侵袭、迁移能力均降低，提示AnnexinⅡ在胃癌转移过程中发挥了重要的作用。胃癌的发生、发展是一个复杂的多因素参与的综合结果，目前关于胃癌的病因学和发病机制研究较多，但并未明了，本研究证实了AnnexinⅡ在胃癌组织中高表达并且具有促进胃癌转移的重要作用。随着相关研究的不断深入，AnnexinⅡ基因的表达、生物学功能及在胃癌进展中的作用将逐步明确，有望应用于胃癌的早期检测、诊断和治疗，成为胃癌预测预后的标志物和治疗靶点。

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The expression of Annexin II in gastric cancer and the role in gastric cancer metastasis

HAN Feng1HUANG Hua2#LV Huang-yong1NIE Chuan1LIN Ling1
1Deparement of Gastroenterology，the PLANo.59 Hospital，Kaiyuan 661600，Yunnan，China
2Deparement of Gastroenterology，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650000，Yunnan，China

ObjectiveTo investigate the significance and the role of Annexin II expression in gastric cancer tissues and gastric cancer metastasis.MethodExpression of annexin II in 51 cases of gastric cancer and 24 cases of adjacent normal gastric tissues was detected by immunohistochemistry staining，then the correlation between positive expression of Annexin II and clinical characteristics of gastric cancer patients were summarized and analyzed.Annexin II specific siRNA interference was established in human gastric cancer HGC-27 cells to downregulate the expressions of Annexin II，and cell adherence test and cell invasion test were performed to evaluate the adhesion and invasion potential of gastric cancer cells as Annexin II expression was inhibited.ResultThe positive expression rate of Annexin II in gastric cancer tissues was 82.4%，significantly higher than that in the adjacent normal gastric tissues at 37.5%，with significant difference observed（P＜0.01）；Besides，the positive expression of Annexin II was independent of gender or age of gastric cancer patients（P＞0.05），while was correlated with tumor size，histological differentiation，clinical TNM stage，and lymph nodes metastasis（all P＜0.05）.The transfection of Annexin II siRNA in human gastric cancer HGC-27 cells led to significant decreases of Annexin II protein and mRNA（P＜0.05），and as the Annexin II expression was downregulated，the adhesion and invasion potential of human HGC-27 gastric cancer cells were significantly decreased（P＜0.05）.Conclusion Annexin II is over-expressed in gastric cancer tissues and the positive expression of Annexin II is correlated with tumor size，histological differentiation and lymph node metastasis，and the high expression of Annexin II may promote the metastasis of gastric cancer，so Annexin II may be an alternative and potential target for preventing metastasis of gastric cancer，and annexin II targeted medication is a promising option in countering cancer metastasis.

gastric cancer；annexin II；metastasis

R735.2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.07.11

2016-01-15）

（corresponding author），邮箱：hanfeng568@sohu.com