哈萨克族食管癌组织中microRNA-21的表达及其意义△

孙清超　宗亮　张海平　张力为　张铸　邓彦超

新疆医科大学第一附属医院胸外科，乌鲁木齐　830054

哈萨克族食管癌组织中microRNA-21的表达及其意义△

孙清超宗亮张海平张力为#张铸邓彦超

新疆医科大学第一附属医院胸外科，乌鲁木齐830054

目的探讨哈萨克族食管癌组织中microRNA-21（miRNA-21）的表达及其意义。方法收集72例哈萨克族食管癌患者临床样本，采用实时定量PCR检测食管癌组织、周围正常食管组织miRNA-21表达水平；以患者性别、年龄、临床分期、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移、病情是否恶化等作为观察指标，分析miRNA-21与临床资料的关系。再以肿瘤中位生存期作为观察指标，筛选出影响哈萨克族食管癌患者预后的危险因素。结果食管癌组织miRNA-21相对表达量为（7.57±0.14），周围正常食管组织相对表达量为（1.37±0.08），食管癌组织相对表达量高于正常组织（P＜0.05）。72例食管癌患者分为miRNA-21高表达组42例和低表达组30例，miRNA-21表达与临床分期、淋巴结转移、肿瘤进展有关，即淋巴结转移、肿瘤进展及肿瘤临床分期越晚，肿瘤miRNA-21表达也越高（P＜0.05）；miRNA-21高表达组5年生存率为20.7%，低表达组5年生存率为38.6%，两组5年生存率比较差异具有统计学意义（χ2=4.715，P=0.005）；多因素分析显示，临床分期、肿瘤进展、miRNA-21表达水平是影响哈萨克族食管癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05）。结论miRNA-21在食管癌组织表达水平高于正常组织，且miRNA-21表达越高，患者预后越差，miRNA-21可以作为哈萨克族食管癌诊断及预后评价的指标之一。

微小RNA；食管癌；哈萨克族；预后；生存率；影响因素

Oncol Prog，2016，14（7）

新疆是我国多民族居住区，各民族生活、居住、风俗情况不一。调查显示［1-2］，新疆地区食管癌病死率为13.05/10万，而哈萨克族发病率最高（68.88/10万），其中新疆塔城地区托里县哈萨克族发病率为155.9/10万，比其他少数民族地区高2～3倍，比全国平均病死率高2.3倍，病死率在全国少数民族中占第一位。由于食管癌病情隐匿，大多患者确诊时已处于中晚期，即使给予放疗、化疗或手术治疗，其5年生存率仅为14.6%～26.3%，其中75%以上的食管癌患者于确诊后1年内死亡［3］。因此早期诊断食管癌对降低其病死率具有重要意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是生物体内一种内源性非编码小分子RNA家族，长约18～23 nt，具有高度的生物保守性。国外研究［4］证实miRNA能够与靶基因mRNA的3´-非翻译区（3´-UTR）特异性结合，并诱导mRNA降解或抑制翻译，从而参与调节细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭等生物学行为。本研究对食管癌组织及周围组织miRNA-21进行定量分析，并进一步探讨miRNA-21表达与哈萨克族食管癌病理生物学参数之间关系，旨在为哈萨克族食管癌的诊断、治疗和预后评估提供依据。

1　资料与方法

1.1一般资料

收集2008年7月至2010年12月在新疆医科大学第一附属医院胸外科行手术治疗的72例哈萨克族食管癌患者临床资料，其中男43例，女29例，年龄27～74岁，平均（52.6±6.1）岁；发病部位：胸上段食管癌15例，中段食管癌31例，下段食管癌26例；其中低分化肿瘤16例，中分化肿瘤26例，高分化肿瘤30例；按照美国癌症联合委员会［5］American joint committee on cancer，AJCC）食管癌临床分期标准分为Ⅰ期9例，Ⅱ期27例，Ⅲ期25例，Ⅳ期11例。纳入标准：①所有患者均经病理学证实为食管癌；②所有患者民族均为哈萨克族；③入组前未进行抗癌治疗；④预计生存期≥6个月；⑤术中取出病理标本，并冷冻切片保存；⑥患者及家属获知研究方案，并签署知情同意书。排除标准：①新疆地区非哈萨克族患者；②患者病历资料不完整；③远端转移或合并其他恶性肿瘤者；④预计无法正常随访。

1.2方法

1.2.1miRNA-21检测术中将瘤体组织切除，同时切取距肿瘤边缘5 cm以上的切缘组织（术后病理学证实为正常食管组织）；将组织切片充分研碎，在严格无菌操作下用RNA提取试剂盒将总RNA提取（RNA试剂盒购自美国invitrogen公司），检测提取后的总RNA吸光度值（optical delnsity，OD），OD260/280值1.8～2.0。再将总RNA用逆转率试剂盒逆转录为cDNA，以cDNA为模板，实时定量miRNA-21作为引物进行PCR反应，反应条件：引物浓度0.3 μmol/L，96℃变性20 s，60℃退火45 s，总计35个循环。70～94℃绘制熔解曲线，分析PCR熔解曲线，每个样本设3个平行孔，以miRNA U6的Ct值作为内参照，计算miRNA-21的相对表达量（2-△△Ct）。引物序列如下：

miRNA-21引物内参U6上游：5´-AACGUCAUCCGCUGUGAGAUUC-3´下游：5´-CCGCAUGAAGAUUAGUUGCGUA-3´上游：5´-ACGGGCTGTCAGCTAAAGCC-3´下游：5´-GACGGCACACGAGTCG-3´

1.2.2随访对72例患者进行为期5年的随访，随访至2016年2月，随访以门诊复查、电话回访等方式，起始日期以术后第2天开始计算，截止日期为患者死亡或失访的时间。

1.2.3观察指标记录患者5年生存率、中位生存期。以患者性别、年龄、临床分期、肿瘤部位、分化程度、病情是否恶化等作为观察指标，分析miRNA-21与临床资料的关系。再以肿瘤中位生存期作为观察指标，筛选出影响哈萨克族食管癌患者预后的危险因素。

1.3统计学方法

采用SPSS 22.0统计-学软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用两独立样本t检验，计数资料以百分比（%）的形式表示，比较采用χ2检验；患者生存曲线采用Kaplan-Meier法，组间生存情况比较采用Log-rank test，多因素采用Cox回归模型，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1食管癌组织及正常组织miRNA-21表达水平

以U6作为内参，食管癌组织miRNA-21相对表达量为（7.57±0.14），周围正常食管组织相对表达量为（1.37±0.08），食管癌组织miRNA-21相对表达量高于正常组织（P＜0.05）。

2.2miRNA-21表达与临床资料的关系

以食管癌组织miRNA-21相对表达量（7.57± 0.14）作为临界值，大于或等于（7.57±0.14）为高表达组，小于为低表达组。将72例食管癌患者分为miRNA-21高表达组42例和低表达组30例，高表达组和低表达组性别、年龄、肿瘤发生部位、分化程度比较差异无统计学意义（P＞0.05）；临床分期、肿瘤进展（肿瘤进展的定义：瘤体最大径之和至少增加≥20%，或出现新病灶）、淋巴结转移比较差异有统计学意义（P＜0.05），高表达组Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤进展、淋巴结转移发生率高于低表达组（P＜0.05）。（表1）

2.3miRNA-21表达与食管癌患者生存率的关系

72例患者均获得随访，随访时间5～60个月，平均（37.4±4.2）个月；miRNA-21高表达组5年生存率为20.7%，低表达组5年生存率为38.6%，两组5年生存情况比较差异具有统计学意义（χ2=4.715，P=0.005）。（图1）

2.4哈萨克族食管癌患者预后单因素分析

Log-rank分析结果显示，临床分期越晚、肿瘤进展、淋巴结转移、miRNA-21高表达的患者中位生存期均显著缩短（P＜0.05）。（表2）

2.5哈萨克族食管癌患者预后多因素分析

Cox回归模型分析显示，临床分期、肿瘤进展、miRNA-21表达水平是影响哈萨克族食管癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05）。（表3）

表1　不同miRNA-21表达与临床资料的关系［n（%）］

图1　miRNA-21表达水平与5年生存率的关系

3　讨论

食管癌的发生是一个复杂过程，包括许多外在因素如某些化学物质、营养缺乏、物理因素、生物因素等［6-7］。内在的遗传因素也是食管癌发生的影响因素，抑癌基因失活或原癌基因激活是重要原因之一［8］。miRNA在肿瘤发病机制中起关键作用，国外研究［9］证实一部分miRNA在肿瘤发生发展中具有癌基因功能，在肿瘤组织中常常过表达，影响肿瘤的发生发展；另一部分miRNA则具有抑癌基因功能，在肿瘤中表达缺失或下调。miRNA-21是一种位于17q23.2染色体FRAl7B区域上，且具有自主转录单位的miRNA，近年来研究［10］发现miRNA-21在多种实体瘤中表达上调，并证实其通过复杂的调控机制参与了肿瘤的发生与发展。刘启飞［11］研究证实miRNA-21在肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、胃癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌瘤、肝癌、胆管癌、结肠癌、前列腺癌中呈现高表达。王丽丽等［12］也证实miRNA-21高表达显著增加了肿瘤细胞的增殖及侵袭，而将miRNA-21敲除后，肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力明显下降。

目前有关新疆地区哈萨克族食管癌病因及发病机制方面的研究仍不是很成熟，哈萨克族人群生活和居住情况有其特殊性，如该民族极少与其他民族通婚、生活居所不定、喜食酸奶疙瘩、烟熏肉、烫食、咀嚼纳斯、蔬菜水果摄入少及营养不平衡等，因此食管癌发病具有明显的家族聚集性特点。Androsavich等［13］对食管鳞状细胞癌、正常食管上皮组织及食管鳞状细胞癌的细胞株miRNA-21进行定量PCR检测，结果显示食管癌组织miRNA-21表达水平显著高于正常食管上皮组织，当存在淋巴结转移时，miRNA-21表达亦显著升高。因此检测哈萨克族食管癌患者miRNA-21的表达水平，对揭示其在哈萨克族食管癌中的发生机制方面占重要地位。本研究显示，哈萨克族食管癌组织miRNA-21相对表达量高于正常食管上皮组织，提示miRNA-21可能参与了食管癌的发生发展。潘雪和李向楠［14］对食管鳞状细胞癌组织采用原位杂交技术检测，结果也证实miRNA-21表达呈强阳性。进一步分析miRNA-21表达与患者临床病理资料的关系，结果显示miRNA-21表达与临床分期、肿瘤进展、淋巴结转移有关，即肿瘤临床分期越晚，肿瘤进展及淋巴结转移患者miRNA-21表达越高，这亦提示miRNA-21与肿瘤的侵袭、转移及病情发展有关。高楚蒙等［15］研究显示，miRNA-21能够直接作用于RECK基因，进而诱导骨肉瘤的侵袭和转移。赵遵兰等［16］亦证实，乳腺癌细胞中miRNA-21与TIMP3表达水平呈负相关，miRNA-21可能通过抑制TIMP3表达促进乳腺癌细胞的转移。

表2　哈萨克族食管癌患者预后单因素分析

表3　哈萨克族食管癌患者预后多因素分析

在对哈萨克族食管癌患者预后的影响因素进行分析，结果显示临床分期、肿瘤进展、miRNA-21表达水平是影响患者预后的独立危险因素，miRNA-21表达越高，患者预后越差。Okayama等［17］证实miRNA-21可以作为判断肺癌分期、治疗及诊断的指标之一，miRNA-21高表达亦是肺癌患者预后的负性因素。miRNA-21调节的信号通路目前仍不清楚，有报道［18-19］称miRNA-21能够活化AKT/ PI3K信号通路，导致肿瘤细胞对抗肿瘤治疗产生耐受。Markou等［20］则称miRNA-21具有抑制肿瘤细胞周期的作用，当细胞被阻滞于G2/M周期，导致对射线和化疗不敏感，这亦是食管癌放化疗失败的诱因之一。当然，食管癌的形成是个复杂的过程，多种基因均参与了其中的调节，miRNA-21也并非是唯一一个改变的基因型，而这些改变的基因是否存在相互作用依然需要进一步研究。

综上所述，miRNA-21在食管癌组织表达水平高于正常组织，且miRNA-21表达越高，患者预后越差，miRNA-21可以作为哈萨克族食管癌诊断及预后评价的指标之一。

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Clinical significance of microRNA-21 expression level in esophageal cancer tissue in Kazakh△

SUN Qing-chao ZONG Liang ZHANG Hai-ping ZHANG Li-wei#ZHANG Zhu DENG Yan-chao
Department of Thoracic Surgery，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China

ObjectiveTo explore the clinical significance of miRNA-21 expression level in esophageal cancer in Kazakh.Method72 samples of esophageal cancer tissues were collected from Kazakh patients，and the expression of miRNA-21 in esophageal cancer tissues and adjacent normal tissues was detected by real-time quantitative PCR；Age，clinical stage，tumor location，differentiation，lymph node metastasis，and disease progression were summarized to analyze the correlation between miRNA-21 and those clinical measures.Median survival was utilized in evaluating the prognostic factors of esophageal cancer in Kazakh.ResultThe relative expression of miRNA-21 in esophageal cancer tissue was（7.57±0.14），and was（1.37±0.08）in normal esophageal tissues，with significant difference observed（P＜0.05）.72 cases of esophageal cancer patients were stratified as miRNA-21 high expression group（n=42）and low expression group（n=30），then it was found that miRNA-21 expression was related with clinical stage，lymph node metastasis，and tumor progression，i.e.，lymph node metastasis，higher miRNA-21 expression and more advanced clinical stage were associated with higher incidence of tumor progression（P＜0.05）.The 5-year survival rate was 20.7%in miRNA-21 high expression group，while was 38.6%in the low expression group，with statistically significant difference observed（χ2=4.715，P= 0.005）.Multivariate analysis revealed that clinical stage，tumor progression，miRNA-21 expression level were independent risk factors for Kazakh esophageal cancer patients（P＜0.05）.ConclusionEsophageal cancer tissues have higher miRNA-21 expression than normal tissues，and the expression level of miRNA-21 was negatively correlated with prognosis，so miRNA-21 is a potential measure for the diagnosis and prognosis of Kazakh esophageal cancer patients.

micro RNA；esophageal cancer；Kazak；prognosis；survival rate；influencing factors

R735.1

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.07.08

2016-04-08）

新疆维吾尔自治区自然科学基金（2014211C029）

（corresponding author），邮箱：zhangliwei@medmail.com