基于ITS序列的杨柳树亲缘关系分析

韩志校，张军，韩孟迪，李洋，任亚超

（1.河北农业大学，河北保定 071000；2.河北出入境检验检疫局，河北石家庄 050051；3.河北省残疾人联合会，河北石家庄 050081）

基于ITS序列的杨柳树亲缘关系分析

韩志校1，张军1，韩孟迪2，李洋3，任亚超1

（1.河北农业大学，河北保定 071000；2.河北出入境检验检疫局，河北石家庄 050051；3.河北省残疾人联合会，河北石家庄 050081）

该文以12个杨树无性系和4个柳树无性系为研究对象，利用MEGA5.0软件分析了16个无性系ITS序列平均总长度为663bp,其ITS序列区的各碱基含量为：A所占比例在17.14%～17.81%，T所占比例在16.79%～18.05%，G所占比例在31.93%～32.73%，C所占比例在31.89%～33.43%，G+C所占的比例在64.36%～65.66%，其中G+C含量最高的是小叶杨，最低的是窄冠。同时用邻接法构建了杨柳的系统进化树，其结果可以反映各无性系间的亲缘关系，表明ITS技术鉴定分析杨柳无性系植株是可行的。

杨树；柳树；TIS序列；邻接法；亲缘关系

杨树和柳树分别属于杨柳科（Salicaceae）的杨属（Populus）和柳属（Salix），都为落叶树种，是我国重要的阔叶树种，也是防护林、水土保持林、风景林及用材林的重要组成树种，具有较高的生态与经济价值[1-5]。长久以来，杨树和柳树以其种类多样，无性繁殖与种内杂交均容易发生[6-7]，且种间多态性丰富的优点使其在林木遗传与改良学上具有较高的研究价值，深受人们的重视。

ITS即核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS），它位于18S和26S rDNA基因之间，并且被5.8S rDNA基因分为2段，即ITS1和ITS2。植物的rDNA是高度重复的串联序列，它作为一个转录单位有多个拷贝[8-9]。在不同的植物中ITS区的变异情况不同，其中被子植物ITS序列的变异长度较短，能够准确的反应植物的位点信息及其变异情况，实验操作简单易行，是目前在被子植物类群系统与进化研究中应用较为广泛的一种标记技术[10]。在杨属植物中，史良全[11-12]、王明福[13]等用ITS标记方法对杨属植物进行了亲缘关系分析，而对于柳属植物的ITS研究较少，大多在研究杨属植物ITS时，将柳属植物做为外组群辅助对杨属的研究。

试验以12个杨树无性系和4个柳树无性系为试验材料，利用ITS技术对其进行碱基替换、碱基组成和遗传距离分析，并构建16个无性系的系统发育树，旨在从分子水平探讨杨柳的亲缘关系，丰富对杨柳的研究，为杨柳树的遗传改良提供科学依据。

1　材料与方法

1.1 试验材料

试验包括12个杨树无性系和4个柳树无性系。杨树包含白杨派的5个无性系、黑杨派的3个无性系和青杨派的4个无性系，柳树为垂柳（雌）、龙爪柳、沙柳和旱柳的4个无性系（见表1）。

表1 杨树和柳树试验材料

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取

采用CTAB法提取样品DNA，将DNA稀释到80ng/μL，并将其放置在4℃冰箱保存。

1.2.2 引物

试验引物来源于文献[11-12]，其正反引物序列为5′_CGT AAC AAGGTTTCC GTA GC_3′，5′_TCC TCC GCTTATTGATATGC_3′，测序用引物除了扩增双链模板所用正、反向引物外，补充位于5.8s上的中间引物2条（5'-GCTACGTTCTTCATCGAGC-3'，5'-GCATCGATGAAGAACGTAGC-3'），以保证测序的准确性。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 PCR反应体系和扩增程序

﹙1﹚PCR反应。采用20μL体系，其中含2×Taq MasterMix 10μL，Forward primer 1μL，Reverse primer 1μL，Template DNA 2μL，Rnase-Free Water 6μL。

（2）PCR扩增程序。PCR扩增95℃预变性5min后，开始94℃变性50s，50℃退火50s，72℃延伸1min，30个循环，最后一个循环结束，然后72℃延伸7min，4℃保存20min，得扩增产物。

1.2.4 PCR扩增产物的处理

将扩增好的PCR产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并拍照记录条带，同时，将条带亮度高且只有单一条带的，用小刀片轻轻切下装入离心管，送至北京华大基因生物有限公司完成测序。

1.2.5 数据处理与分析

将返回的序列及其峰图进行观察并导出序列加以分析，将序列在MEGA5.0软件上进行成对对比（ClustalW），同时对两端缺失的序列进行删除操作，分析碱基替换、碱基组成和遗传距离等，并用邻接法（Neighbor-joining）构建这16个无性系的系统发育树。

2　结果与分析

2.1 PCR扩增效果检测

将扩增好的PCR产物，在琼脂糖凝胶电泳上做电泳检测后，得到各样品的扩增片段大小在750bp左右，扩增条带单一无杂带且条带亮度很高，即扩增片段特异性较高，符合测序要求（见图1）。

图1 杨树ITS扩增的谱带

2.2 杨柳序列分析

通过对16个杨柳无性系的碱基序列分析，杨柳各无性系间的ITS序列较为相近，在645～669bp之间。在杨柳样本中，都存在不同程度的碱基缺失情况（见表2），在杨属植物中，廊坊杨缺失1个碱基，窄冠、丹红杨、巨霸杨、小叶杨缺失2个碱基，易县毛白杨、84K杨和北林1号缺失3个碱基，青杨和大青杨、朝鲜杨缺失的碱基较多，分别缺失10个和11个碱基，使得其序列相对于其他序列而言较短。在柳属植物样本中，序列长度在662～666bp之间，序列长度变化范围较小，沙柳缺失2个碱基，垂柳（雌）和龙爪柳都缺失5个碱基，旱柳缺失6个碱基，这4个样本的碱基缺少数变化范围较小。

在杨属植物中，ITS序列A所占比例为17.14% ～17.81%，平均值为17.50%；T所占比例为16.79%～ 18.05%，平均值为17.43%；G所占比例为31.93%～ 32.73%，平均值为32.35%；C所在比例为31.89%～ 33.43%，平均值为32.68%。G+C所占的比例为64.36%～65.66%，平均值为64.99%，在12个杨树无性系中G+C含量最高的是小叶杨，达到了65.66%， G+C含量最低的是窄冠，为64.36%。在柳属植物中，ITS序列A所占比例为17.80%～18.09%，平均值为17.90%；T所占比例为17.04%～18.47%，平均值为17.56%；G所占比例为31.38%～32.13%，平均值为31.88%；C所占比例为32.13%～33.03%，平均值为32.63%。G+C所占的比例为63.51%～65.16%，平均值为64.51%，在4个柳树无性系中G+C含量最高的是旱柳，达到了65.16%，最低的是沙柳，为63.51%。

2.3 邻接法构建杨柳的系统发育图

试验用MEGA5.0软件中的邻接法构建邻接树（Neighbor-joining tree），并对杨柳植物样本进行了ITS序列分析。NJ法（Neighbor-joining method，NJ）主要是通过确定距离最近或相邻的成对分类单位来使系统树的总长达到尽可能的小。本试验所用的邻接法是将Tamura 3-parameter model［d：Transitions+Transversions；Gamma Distributed（G），Gamma parameter=5］作为进化距离参数的模型，1000次重复抽样检验并以靴带率（Bootstrap rate）来表示各分支的支持率，得到杨柳资源的系统进化树（图2），其中得到的进化树的树枝总长为0.043。

表2 ITS序列长度、GC含量及各碱基含量

图2 基于rDNA ITS序列采用邻接法获得的杨柳树系统发育树

通过对系统发育树观察分析得到，整个系统发育树可以分为两大支，即杨树无性系为一支，柳树无性系为一支。在杨树无性系中，又可以分为3个分支，5个白杨派无性系为一个分支、3个青杨派无性系为一个分支，最后一个分支是3个黑杨派无性系和青杨派的小叶杨，其中青杨派和黑杨派的无性系又聚在了一起，表明两派之间的亲缘关系较近。在柳树资源中沙柳单独聚为了一支，其余3个无性系聚在了一起。

在NJ图中，16个样品分为两大支，分别为杨属植物一支，柳属植物一支。在杨属植物中，黑杨派、青杨派和白杨派以100%的支持率聚在了一起，青杨派与黑杨派以94%的支持率聚为了一类，朝鲜杨和大青杨的支持率为36%，低于50%，其余样品之间的支持率都大于50%。在柳属资源中，垂柳、旱柳、龙爪柳聚为了一类，沙柳再与之聚在一起，它们之间的支持率都大于50%。

3　讨论

随着生物技术的不断发展，ITS分子标记方法得到了广泛的应用，其主要是与细胞学、一般分子标记等方法相结合来确定生物种起源、进化方向及与其他类群的关系等方面[14]。本文对16个杨柳无性系的系统发育树进行了构建，其结果能较好的展现杨属和柳属各自无性系在系统中的进化关系和亲缘关系，表明ITS可以应用于杨柳系统发育研究中。

在杨属植物聚类中，白杨派无性系单独成为一个分支，而黑杨派无性系与青杨派无性系形成另一个分支，结果说明白杨派无性系相对于其他派无性系比较原始，亲缘关系较远，黑杨派与青杨派无性系关系较近。这也与trnL-F[15-16]、分子标记[17-18]等其他生物技术方法得到的结果一致。本文中，青杨派的小叶杨与黑杨派无性系聚为了一类，而育种实践也证明了小叶杨与黑杨派无性系的亲缘关系较近，亲和力较强，易于产生杂交后代。白杨派作为杨属的一个原始分支，被认为是单系起源。本文通过利用ITS序列构建的系统发育树分析结果，同样证明了白杨派是单系起源，但在传统白杨派分为白杨和山杨两个亚派上，本文结果未能很好的区分，窄冠毛白杨与山杨以84%的支持率聚为了一类。

在柳属植物聚类中，刘明航等[19]认为垂柳、旱柳、龙爪柳为种内变异水平，应该为一个种。本文对柳属无性系的聚类分析与之一致，说明三者亲缘关系较近。从系统发育树可以看出，沙柳与垂柳、旱柳、龙爪柳分为了两支，且支持率为100%，沙柳为筐柳组，其余3个为柳组，说明ITS标记方法可以作为鉴定柳属植物的方法。

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Analysed the Genetic Relationship of Populus and Salix by ITS

HAN Zhi-xiao1,ZHANG Jun1,HAN Meng-di2,Li Yang3,REN Ya-chao1
（1.Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China;2.Hebei Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,ShiJiazhuang, 050051，China;3.Hebei Disabled Persons，Federation,ShiJiazhuang,050081，China）

In this paper,12 poplar clones and 4 willow clones are analysed by the software of MEGA5.0.In the study,12 populus clones and 4 salix clones′length of ITS region sequence is 663.0bp in average.According to these samples in ITS region sequence,the base frequencies remains different in different species,the proportion of A between 17.14%～17.81%,the proportion of T between 16.79%～18.05%,the proportion of G between 31.93%～32.73%,the proportion of C between 31.89%～ 33.43%,the content of G+C is from 64.36%（zhaiguan）to 65.66%（Populus simonii Carr.）.Populus and Salix were constructed phylogenetic tree using Neighbor-Joining and the results may reflect the genetic relationship between all clons,and so it is feasible to identify and analyze the resources of populus and salix by ITS.

Populus；Salix；ITS；NJ

S718.49

A

1002-3356（2016）01-0023-04

2015-12-13

国家林业局项目“木本植物品种DNA分子图谱研究”资助。

韩志校（1987-），女，河北石家庄人，硕士研究生，河北农业大学国有资产管理处实验室管理科，主要从事实验室管理工作。E-mail:hzx19870517@126.com。

张军（1979-），男，河北石家庄人，讲师，博士，河北农业大学林学院，主要从事林木遗传育种工作。E-mail: zhangjunem@126.com。