具ACE抑制活性的油茶饼粕酶解物的制备及分离表征

高刚峰，陈勇强，陈养，陈莉，沈双玲

（1.三明市生物医药及生物产业工作办公室， 福建 三明 365000；2.福建省农产品加工推广总站，福建 福州 350001；3.尤溪县林业局，福建 尤溪 365100）

具ACE抑制活性的油茶饼粕酶解物的制备及分离表征

高刚峰1，陈勇强2，陈养3，陈莉1，沈双玲1

（1.三明市生物医药及生物产业工作办公室， 福建 三明 365000；2.福建省农产品加工推广总站，福建 福州 350001；3.尤溪县林业局，福建 尤溪 365100）

以油茶饼粕为原料，研究通过5种蛋白酶水解制备的茶粕酶解物ACE抑制率随酶解时间的变化规律，结果表明除蛋白酶C外，其余4种蛋白酶水解的茶粕酶解物ACE抑制率随酶解时间呈现先增加后减小的趋势。比较不同蛋白酶水解的茶粕酶解物ACE抑制活性得出经蛋白酶A水解后的茶粕酶解物具有较高的ACE抑制率（94.4%）；为获得高纯度并具有高ACE抑制活性的酶解组分，文章采用CM-SephadexC-25阳离子交换色谱和RP-HPLC纯化经蛋白酶A酶解的茶粕酶解物。由CM-SephadexC-25阳离子交换色谱分离得到一个组分A，通过RP-HPLC进一步分离组分A得到6个组分。对ACE抑制率最高的组分A-2 进行RP-HPLC二次纯化，得出该分离组分达到色谱纯，其半数抑制浓度（IC50）为98μg.mL-1。

油茶饼粕；ACE抑制率；RP-HPLC

ACE抑制活性物质通过抑制ACE活性达到降血压的作用。它们对ACE活性区域的亲和力大于血管紧张素I(Angiotensin I)和缓激肽(BradykininI)对ACE的亲和力，并且一旦和ACE活性区域结合就难于释放，从而阻碍ACE催化水解血管紧张素I(AngiotensinI)成为血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ)以及催化水解缓激肽(Bradykinin)成为失活片段的两种生化反应过程，起到降血压的作用[1,2]。目前，微生物发酵或蛋白酶水解是生产ACE抑制活性物质的最常用的方法，其次还有从自溶产物中提取、DNA重组技术及化学合成等方法[3-6]。酶法水解是目前获得ACE抑制活性物质的主要途径，该方法的优点是生产成本低，而且产品的安全性高，无副作用。

茶籽饼又名油茶饼粕，别名茶麸、茶枯，呈紫褐色颗粒，是野山茶油果实榨油后剩下的渣，其数量相当于茶油的3倍。我国年产茶油约15万t，茶籽饼约50万t[6]。用有机溶剂将茶籽饼进行进一步提油后的残渣即为茶粕。全国每年有榨油后剩下的约50万t。根据分析测定，油茶饼粕中富含蛋白质、脂肪、淀粉、茶皂素、粗纤维，茶粕蛋白质中含有18种氨基酸，包括畜禽生长所需的10种必需氨基酸，其中苏氨酸、谷氨酸、组氨酸和精氨酸等含量较为丰富[1，8]。但由于茶粕味苦有毒，目前基本上被废弃，造成了很大的资源浪费。因此，文章拟对茶粕进行深度开发和利用，通过酶解技术制备具ACE抑制活性的茶粕酶解物，再经过色谱等分离方法对酶解产物的ACE活性活性物质进行分离和表征。

表1 酶解处理表

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料和药品

油茶饼粕，沈郎食用油公司提供，粉碎过筛待用；蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D和蛋白酶E，丹麦NOVE公司；马尿酰组氨酰亮氨酸（HHL）、血管紧张素转化酶（ACE），Sigma公司。

1.1.2 仪器和设备

HH-8型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；V-1200型可见光分光光度计：上海美谱达仪器有限公司； SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；ML-902型磁力搅拌器：上海浦江分析仪器厂；TDL-5-A型台式离心机：上海安亭科学仪器厂；868型pH计：Orion Research公司；KQ-250E型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；TE601-L型，BS110S型电子天平：北京赛多科斯天平有限公司；EasySepTM-1010型高效液相色谱仪：上海通微分析技术有限公司；CM-SephadexC-25阳离子交换柱：上海贺宝化工有限公司；BS-100A型自动部分收集器：上海沪西分析仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 茶粕酶解物的制备

将底物浓度为2.5%的茶粕置于250mL三角瓶中，采用表1的处理方法进行酶解，水解在恒温水浴振荡器中进行。反应结束后，将反应体系在85℃下加热使酶失活。

1.2.2 茶粕酶解物的分离纯化

1.2.2.1 离心和微滤

酶解液经过离心机4000r.min-1离心10min，收集上清液；将上清液经过膜孔径为0.2um的无机膜微滤，收集滤液供后续分离操作。

1.2.2.2 离子交换层析初步分离

阳离子交换树脂预处理参照赵永芳[9]方法，采用湿法填柱。

将滤液（经过透析除盐）20mL上样至CMSephadexC-25阳离子层析柱，分离条件为：凝胶柱φ1.6×15cm，洗脱液0.02mol.L-1pH3.8醋酸-醋酸钠缓冲溶液和1mol.L-1氯化钠溶液，氯化钠线性洗脱梯度0～ mol.L-1，流速为0.5mL.min-1，每管收集时间为10mL，检测波长为220nm。

1.2.2.3 RP-HPLC分离纯化

[10]并略作改动。将经离子交换层析分离的组分冻干，适当稀释后采用RP-HPLC进一步分离。色谱条件：色谱柱EasySepTMC18 分析型色谱柱（5um4.6⋆250mm），检测波长220nm，柱温25℃；流速1mL.min-1；洗脱条件：0～5min，100%A；5～20min，100%A～60%A；20～30min，60%A～100%B；30～50min，100%B（A：0.05%TFA+5%乙腈，B：80%乙睛+0.05%TFA）。收集各组分峰，重复进样，收集多次，冷冻干燥，并测定每个组分峰的ACE抑制活性。经 RP-HPLC一次制备的具有最高ACE抑制活性的组分再次进行二次纯化。

1.2.3 茶粕酶解物水解度的测定

参考文献甲醛滴定法[8]

1.2.4 ACE抑制活性的测定

ACE抑制率根据参考文献[11]和[12]的方法测定，ACE半数抑制浓度(IC50)的测定参考文献[13]。

2 结果与分析

2.1 酶解时间与ACE抑制率的关系

5种蛋白酶酶解的茶粕酶解物ACE抑制率和水解度随酶解时间的变化趋势见图1。

从图1可以看出，水解度随着时间的延长而增大，符合酶解的一般规律；但是，茶粕酶解物的ACE抑制率并不随时间增加而增大，除蛋白酶C外，其余四种蛋白酶酶解的茶粕酶解物ACE抑制率随酶解时间的延长呈现先增加后减小的趋势。原因可能是：随着酶解时间的延长，原来酶解出的具有ACE抑制活性的物质被进一步酶解，酶解物的端基和肽链长度等发生了变化，使得之前酶解出的物质失去了原有的ACE抑制活性，所以，ACE抑制活性不会随着氨基氮含量呈先增加后稳定的趋势变化。从图中还可以看出，不同酶解时间所获得的茶粕酶解物都体现出一定的ACE抑制活性，即存在着多种ACE活性抑制物质。这一现象与吴建平等人的报道基本一致[14]，即ACE是一类专一性相对较弱的酶，在蛋白质经酶解后的酶解物中，存在着多种ACE抑制活性物质，这些ACE抑制活性物质并非是简单的或有或无。

2.2 不同蛋白酶酶解的茶粕酶解物ACE抑制率的对比分析

由图2可知，没有经过酶解的茶粕提取液就存在74.5%的ACE抑制率，说明茶粕提取液本身就含有一定的ACE抑制活性物质。茶粕经蛋白酶酶解后，抑制率均有所提高，最高提高了27%，说明酶解液中有ACE抑制活性物质的存在。五种酶水解后的ACE抑制活性大小依次为：蛋白酶A＞蛋白酶D＞蛋白酶E＞蛋白酶C＞蛋白酶B；从氨基氮含量来看，蛋白酶C水解后氨基氮含量最高。相比之下，其他酶解液的氨基氮含量偏低，尤其蛋白酶D，其氨基氮含量只有0.037mg.mL-1，但抑制率就高达92.8%。

ACE抑制肽大约包含2～12个氨基酸残基，有研究表明分子质量小利于肽在体内的吸收利用，但也有极个别的由27个氨基酸组成的降血压肽被发现。降血压肽的抑制活性与其氨基酸结构和组成密切相关。经研究认为ACE抑制肽的抑制活性主要取决于C端氨基酸， C端氨基酸为芳香族氨基酸（包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸）时，其抑制活性较高。而且，C端残基上带正电荷的氨基酸的存在可以显著增强降压肽的抑制活性，如精氨酸（胍基）。此外，ACE抑制肽的疏水性也是影响其活性的重要因素，高亲水性使其无法接近ACE活性部位而导致弱或无活性。这些对ACE抑制肽的结构分析还局限于对已知氨基酸序列的肽进行定性的分析，许多肽并不符合这些研究结果，确切的构效关系模型至今仍未建立，有待进一步的研究[1,15]。

蛋白酶B、C氨基氮含量高，但ACE抑制率偏低，这可能与这两种酶是具有内切蛋白酶和外切蛋白酶两种活性酶有关。内切酶和外切酶同时存在于一个酶解反应体系时，对增加酶解物中氨基酸的量和改善酶蛋白多肽的风味有好处，但可能不利于制备功能活性物质[16]。

蛋白酶A、蛋白酶D和蛋白酶E酶解液的ACE抑制率均很高是由于这些酶的酶切位点均含有芳香族的氨基酸，这些氨基酸都具有ACE抑制活性。例如：蛋白酶D酶切位点所形成的氨基酸残基中苯丙氨酸、色氨酸均是ACE抑制肽的端基组成，并且酶切后形成的丙氨酸残基是疏水性氨基酸，酪氨酸残基是带正电荷的氨基酸残基，这都有利于增强ACE抑制的活性，所以蛋白酶D酶解后的茶粕酶解物ACE抑制性很高。

2.3 茶粕酶解物的分离纯化

2.3.1 离子交换层析分离茶粕酶解物

茶粕经蛋白酶酶解的产物经CM-SephadexC-25阳离子交换层析分离的色谱见图3。从图3中可以看出分离结果只有一个峰A，其220nm的吸光值为0.409。

2.3.2 RP-HPLC分离纯化组分A

将CM-SephadexC-25阳离子交换层析分离得到的A组分进行RP-HPLC进一步分离，分离结果见图4。组分A经RP-HPLC分离得到6个分离组分，分别标记为：A-1、A-2、A-3、A-4、A-5和A-6。测定各分离组分ACE抑制率见表2。

表2 RP-HPLC各分离组分的ACE抑制率

根据表2结果，组分A-2的ACE抑制率最高。将组分A-2进行RP-HPLC二次纯化，结果见图5。由图5可知，组分A-2基本达到色谱纯。

3 结论

5种蛋白酶（蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D和蛋白酶E）酶解后的茶粕酶解物ACE抑制率和氨基氮含量随酶解时间的变化规律为：氨基氮含量随酶解时间呈现先增加后稳定的变化趋势，而酶解产物的ACE抑制率并没有随氨基氮含量的增加而增加；除了蛋白酶C外，其他4种蛋白酶的酶解液ACE抑制率都是随着时间的延长呈现先增加后减小的变化趋势，蛋白酶C的酶解产物则是随时间呈现波动变化。5种蛋白酶水解产物的ACE抑制活性大小依次为：蛋白酶A＞蛋白酶D＞蛋白酶E＞蛋白酶C＞蛋白酶B。其中，经蛋白酶A水解后的酶解产物ACE抑制率最高，达到94.4%，对应的氨基氮含量为0.048mg.mL-1。

采用CM-SephadexC-25阳离子交换色谱和RPHPLC纯化经蛋白酶A酶解的茶粕酶解物。由CMSephadexC-25阳离子交换色谱分离得到一个组分A，通过RP-HPLC进一步分离组分A得到6个组分。对ACE抑制率最高的组分A-2 进行RP-HPLC二次纯化，分离图谱为单峰，说明该分离组分达到色谱纯，其半数抑制浓度(IC50) 为98μg.mL-1。

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Q555

A

1007-550X（2016）01-0043-05

10.3969/j.issn.1007-550X.2016.01.001

2015-11-24

高刚峰（1964-），男，高级工程师。