荧光光谱法研究分解后白术挥发油与β -环糊精和羟丙基-β -环糊精的包合作用

赵红红， 阎克里， 刘焕蓉*

(1.山西大学化学化工学院，山西太原 030006；2.山西省肿瘤研究所，山西太原 030013)

将不稳定的白术挥发油进行彻底的氧化分解后，产物稳定[1]。该稳定的分解后白术挥发油(Decomposed Volatile Oil fromAtractylodesMacrocephalaKoidz，DVOA)可杀伤抑制及诱导人类卵巢癌细胞SKOV-3细胞凋亡，且在凋亡早期、晚期均可发挥作用[2]。为将分解后白术挥发油开发为抗肿瘤新药，需对其进行制剂工艺的研究。

环糊精(CD)分子具有中空圆筒的立体环状结构，外亲水、内疏水，其内部疏水空腔可嵌入各种化合物。采用环糊精包合技术可使挥发油粉末化以减少药效成分的挥发、掩盖不良气味，增加挥发油水溶性及其生物利用度[3,4]，而β-环糊精(β-CD)和羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)因分子空洞适中，参与机体代谢，使用安全，被广泛应用于医药领域。在包合反应中，荧光光谱法因选择性好，灵敏度高，容易操作及经济实用等特点得到广泛应用[5,6]。利用荧光光谱法研究一些单分子药物在溶液中与β-CD和HP-β-CD的包合作用已有报道[7 - 11]。但荧光光谱法在β-CD和HP-β-CD与中药多组分挥发油包合作用中的应用未见报道。

本文采用荧光光谱法研究了β-CD和HP-β-CD与分解后白术挥发油的包合特性，测定了包合物的包合比和包合常数，并对挥发油与HP-β-CD包合过程中的热力学参数进行了研究，旨在为分解后白术挥发油包合物的制备提供可靠理论依据，为将分解后白术挥发油开发为抗肿瘤新药奠定基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Varian Cary Eclipse荧光光谱仪(美国，瓦里安(中国)有限公司)；THZ-82A型水浴恒温振荡器(江苏省金坛荣华仪器制造有限公司)。

β-环糊精(β-CD)和羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)购于郁南县永光环状糊精有限公司。分别精密称取干燥的β-CD 1.135 g、HP-β-CD 2.354 g，用水溶解并定容至100 mL，配制成浓度为10 mmol/L的储备溶液。分解后白术挥发油参考文献方法[1]制备。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

在10 mL具塞试管中，依次加入分解后白术挥发油10 mg，一定体积环糊精储备溶液，加水至10 mL，充分振荡后，静置。取上清液经0.22m滤膜过滤后，在激发波长范围300～450 nm、发射波长范围380～700 nm内，进行荧光光谱扫描，激发和发射光谱通带宽度均为5 nm，并同时进行空白水溶液的荧光光谱扫描。

2 结果与讨论

2.1 挥发油的荧光光谱

按1.2中方法扫描空白水溶液无荧光发射，分解后白术挥发油在水溶液中的荧光光谱如图1所示。由图1可知，分解后白术挥发油的激发波长为375 nm，发射波长为460 nm，即挥发油在375 nm的紫外光下发射蓝色荧光，其中荧光物质为挥发油的主要活性成分香豆素类的倍半萜内酯。

2.2 包合时间对包合体系荧光强度的影响

按1.2中的方法，分别考察了温度25 ℃下，β-CD和HP-β-CD浓度均为1 mmol/L时，包合时间对包合体系荧光强度的影响，结果见图2。图2显示：包合体系荧光强度随振荡时间的增加而逐渐增大，24 h后趋于稳定，表明β-CD和HP-β-CD与挥发油已充分包合且稳定，因此24 h选为最佳包合时间。

图1 分解后白术挥发油的荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectrum of DOVA

图2 包合时间对包合体系荧光强度的影响Fig.2 Effect of inclusion time on fluorescence intensity of the inclusion system

图3 环糊精浓度对包合体系荧光强度的影响Fig.3 Effect of concentration of cyclodextrin on fluorescence intensity of the inclusion system 1-6：0，1，2，4，6，8 mmol/L,respectively.

2.3 环糊精浓度对包合体系荧光强度的影响

按1.2中方法，分别考察了温度25 ℃下，β-CD和HP-β-CD浓度对包合体系荧光强度的影响，荧光光谱如图3所示。图3结果显示：460 nm波长处，随着β-CD和HP-β-CD浓度的增加，分解后白术挥发油的发射波长不变，而荧光强度均逐渐增大。这是由于β-CD和HP-β-CD与挥发油发生了包合作用，二者的疏水空腔保护了分解后白术挥发油分子，减少了荧光猝灭，并使其运动的自由度降低，分子间的去活性碰撞减少，从而使量子产率提高，荧光强度增大[8,12]。

荧光增强效应为：HP-β-CD>β-CD。这是由于HP-β-CD分子中羟基少于β-CD，分子柔性大，腔口易扩大，疏水区域深度增加，故显示出更加优良的包合性能[13]。

2.4 包合物包合比和包合常数的测定

假设环糊精与分解后白术挥发油以1∶1包合，根据改进的Benesi-Hildebrand方程：

(1)

假设环糊精与分解后白术挥发油以2∶1包合，且[CD]>>[V]，则有：

(2)

式中：[V]表示挥发油的浓度(mg/mL)；[CD]表示环糊精的浓度(mg/mL)；F、F0分别表示有无环糊精存在时体系的荧光强度；k表示仪器常数；Q表示包合物的荧光量子产率；K表示包合物的包合常数。

以1/(F-F0)对1/[CD]及1/(F-F0)对1/[CD]2分别做双倒数曲线回归分析，若为线性，则由截距与斜率的比值可以得到包合物的K值。温度25 ℃下，β-CD和HP-β-CD与挥发油形成包合物的荧光双倒数曲线见图4。

图4 包合物的双倒数曲线Fig.4 Double reciprocal plots for the inclusion complex

由图4可知：1/(F-F0)与1/[β-CD]和1/[HP-β-CD]均呈良好的线性关系，而与1/[β-CD]2和1/[HP-β-CD]2则无线性关系，表明β-CD和HP-β-CD均以1∶1的包合比与挥发油形成包合物。

按相同的方法得到温度35 ℃和45 ℃下挥发油与β-CD及HP-β-CD包合物的线性回归方程及包合常数K值见表1。

表1 不同温度下包合物的包合常数

由表1可知，随着温度的升高，分解后白术挥发油与β-CD及HP-β-CD包合物的K值均明显减小，表明包合稳定性随温度的升高而降低；不同温度下，分解后白术挥发油/HP-β-CD包合物的包合常数均大于分解后白术挥发油/β-CD包合物的包合常数，表明分解后白术挥发油与HP-β-CD形成的包合物更稳定。

2.5 分解后白术挥发油/HP-β -CD包合物的热力学参数

图5 分解后白术挥发油/HP-β -CD包合物的范特霍夫方程拟合直线Fig.5 Van’t Hoff plot for DVOA/HP-β -CD inclusion complex

根据Van’t Hoff方程：

lnK=-△H/T+△S/R

(3)

将25 ℃、35 ℃和45 ℃下，分解后白术挥发油/HP-β-CD包合物的K值以lnK对l/T进行线性回归，如图5所示。由回归方程的斜率与截距求得分解后白术挥发油与HP-β-CD包合过程中的△H为-22.3 kJ/mol，而△S为-31.67 J/(mol·K)，由△G=△H-T△S可得到25 ℃、35 ℃和45 ℃下包合过程的吉布斯自由能变△G分别为-12.8、12.5、12.2 kJ/mol。

由上述结果可知，25 ℃、35 ℃和45 ℃下，挥发油与HP-β-CD包合过程中的△G均为负值，表明包合反应均可自发进行。包合过程中的△H和△S也均为负值，表明包合反应为焓驱动过程[16]，并为放热反应。由此可预测，若升高温度，包合反应将向相反方向进行，表现为包合物的K值随温度的升高而减小，这与表1中实验计算的K值结果相一致。包合过程负的△S值亦表明，分解后白术挥发油分子进入HP-β-CD的刚性疏水空腔后，自由度下降，从而使包合体系熵值减小[15]。另外，挥发油与HP-β-CD包合反应的焓变小于一般化学反应热，说明该包合反应是一种物理过程，没有共价键的形成，是挥发油成分分子与HP-β-CD分子间氢键、范德华力作用的结果[16]。

3 结论

本文采用荧光光谱法研究了中药多组分分解后白术挥发油与β-CD和HP-β-CD形成包合物的作用过程。在水溶液中，β-CD和HP-β-CD均以1∶1的包合比与挥发油形成包合物，且形成包合物的稳定性为HP-β-CD>β-CD；升高温度，挥发油与HP-β-CD的包合稳定性降低，包合反应可自发进行，且为放热反应，包合过程是挥发油分子与HP-β-CD分子间氢键和范德华力作用的结果。