低温条件对高效液相色谱手性拆分柱效和选择性的影响

徐丽芳， 陈 怡， 陶建伟， 夏寅寅， 宋 巍， 许 旭*

(上海应用技术大学化学与环境工程学院,上海 201418)

高效液相色谱(HPLC)是手性分离分析的主要方法，目前有关HPLC手性拆分的研究比较多的集中在新消旋样品的拆分方法、新拆分固定相研究与应用、相互作用机理等方面[1]。对于一个新的手性样品，尽快获得简单有效的拆分方法仍然是需要研究的课题。

根据热力学方程推导出的色谱手性拆分分离因子(α)与热力学函数之间的关系式[2]，手性拆分可以分为焓驱动与熵驱动的分离，降低温度有利于焓驱动拆分，现有的实验研究结果也显示，多数手性拆分实验在低温条件下具有更好的手性选择性[2 - 12]。但根据范氏方程，在HPLC的高流速条件下，柱效主要受传质阻力的影响，降低温度会降低扩散系数、降低柱效。Herbut等[13]和Li等[14]的实验也证实了这点。这样，低温条件下手性分离的效果就受到选择性和柱效两方面的不同影响而可能出现不同的结果。在通常的HPLC柱温下，Lipka等[8]发现其实验中分离度(RS)、选择因子a和容量因子k′随着温度的降低而增大。我们[6]用手性冠醚柱拆分丙氨酸、正缬氨酸和犬尿氨酸时的实验也显示，降低温度有利于对映体的分离。

通常HPLC手性拆分实验的低温实验多数在5 ℃以上，也有一些0 ℃到-6 ℃的报道[6，7]。最近，温度对拆分的影响再度引起关注。Ilisz等[15 - 17]在-5 ℃到55 ℃的较宽温度范围内研究了温度对氨基酸类似物的手性选择性的影响。Sabia等[18]用Whelk-O1手性柱在-66 ℃分离了药物安定及其类似物的互变对映体。本文以消旋安息香为样品，在低至-40 ℃的更宽温度范围考察了温度对HPLC手性拆分时柱效、保留和选择性的影响，为进一步研究低温条件下的手性拆分方法提供实验依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters高效液相色谱仪由515泵和2487紫外检测器(美国，Waters公司)和英谱色谱工作站(杭州英谱公司)组成；DC-4006型节能型智能恒温槽(宁波新芝生物科技有限公司)。

所用试剂均为国产分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 色谱条件

不同粒径的色谱柱：柱1(Chiralcel OD，250×4.6 mm，10 μm)；柱2(Chiralcel OD-H，250×4.6 mm，5 μm)；柱3(Chiralcel OD-3，250×4.6 mm，3 μm)。流动相为正己烷∶乙醇=70∶30(V/V)。流速根据柱压大小分别选择在0.05～1.2 mL/min之间。检测波长为230 nm。柱温为：-40 ℃、-25 ℃、-10 ℃、5 ℃、20 ℃、35 ℃，控温精度：±0.1 ℃。样品为安息香(浓度0.3 mg/mL)，进样量均为20 μL。

2 结果与讨论

2.1 柱温对柱效的影响

根据10 μm、5 μm和3 μm粒径Chiralcel OD柱分别拆分安息香样品的实验数据，用Oringe7.5软件拟合van Deemter方程的曲线分别如图1。随着温度的降低，高流速时的柱效明显降低，实验中柱压也逐渐增大。3 μm粒径Chiralcel OD柱因为柱压较高，没有进行-40 ℃的实验。

图1 不同粒径Chralcel OD手性柱在不同温度下的流速u与塔板高度H关系曲线Fig.1 The van Deemter curves at different temperatures using Chiralcel OD columns with particle diameter of 10 μm (a),5 μm (b) and 3 μm (c)

根据拟合得到的数据，得不同粒径色谱柱A、B和C项与温度的关系图如图2所示。从图2可以看出，随着温度的降低，系数A基本不变，理论上A项也应是近似不变的值。对于系数B，实验得到的结果在-25 ℃以上时变化不大，各柱的实验值与变化趋势均相近，但当温度降为-25 ℃以下时，两柱B值的结果有差异，有待进一步研究。对于系数C，实验得到的变化趋势均是随着温度的逐渐降低，C值越来越大。与理论推测相符(降低温度会减小扩散系数，从而使C项系数增大)。

图2 10 μm、5 μm、3 μm Chiralcel OD柱在不同温度下A(a)、B(b)、C(c)三项与温度(T)的关系图Fig.2 The relationship between A(a),B(b),C(c) terms and temperature using 10 μm,5 μm,and 3 μm Chiralcel OD columns

2.2 柱温对选择性和容量因子的影响

表1 安息香在10 μm、5 μm和3 μm 粒径Chiralcel OD柱分离时lgα -1/T与lgk′-1/T线性关系

2.3 柱温对分离度的影响

比较消旋安息香在10 μm、5 μm和3 μm手性Chiralcel OD柱不同温度、不同流速下的分离度RS，见图3。可见，随着温度的降低，三根手性柱的分离度呈现不同的变化。

图3 使用不同粒径Chiralcel OD柱分离时分离度(RS)与温度(T)的关系曲线Fig.3 The relationship between resolution(RS) and column temperature (T) using 10 μm(a),5 μm(b),and 3 μm(c) Chiralcel OD column

2.4 讨论

从热力学的角度，降低温度有利于大多数的焓驱动拆分。这种低温条件下的手性识别能力增强的现象，可能与固定相与手性分子在低温下都更加趋于稳定状态且刚性增加、从而提高了手性固定相的识别能力有关。文献[18]提供了一个特殊的例子。另一方面，即使在室温下降低温度会降低熵驱动的分离选择性，如果继续降低温度，只要分离机理不变，在两组分出峰顺序颠倒后也会出现选择性提高的焓驱动现象。因此可以推测，在足够低的温度条件下，可能绝大部分拆分都是焓驱动的，即降低温度选择性提高。这可能为我们改进色谱手性拆分方法提供思路。

根据van Deemter方程，低温会降低柱效，这可能是影响低温条件下手性拆分效果(分离度)的主要问题。实验显示，在0.5～3 cm/min的低流速条件下降低温度对柱效的影响比高流速时小很多。这为改善柱效提供了一条思路。

3 结论

根据安息香在较宽的温度范围内不同柱温下(-40 ℃～35 ℃)的色谱保留和拆分的结果，得到了高效液相色谱在低温条件下的理论塔板高度H与流速u的H-u曲线，对范式方程拟合得到的A、B、C三项系数考察了它们与温度的关系，显示随着温度降低系数A变化不大，系数C随着温度降低逐渐升高，与理论相符。而B项在低温的情况则有待进一步研究。

随着温度的降低，手性选择性提高。1gk′和1gα对1/T均有良好的线性关系，表明保留机理在温度的变化过程中没有发生变化。实验结果提示进一步降低温度可能获得更好的选择性，但要获得好的分离度还需改善柱效。

致谢:大赛璐药物手性技术(上海)有限公司提供了本实验所用的手性色谱柱。