基于新铜试剂的Cu2+荧光探针的合成及性能研究

常 昂， 吴尚荣， 柳 影， 张 鑫， 魏涌标， 李松青， 刘祥军*， 上官棣华

(1.湘潭大学化学学院,湖南湘潭 411100;2.北京分子科学国家实验室,中国科学院化学研究所活体分析化学重点实验室,北京 100190)

荧光传感具有灵敏度高、选择性好、响应时间短、测定过程中所需试样用量少等优点，目前在金属离子快速检测领域得到越来越多的关注[1,2]。Cu2+是一种在生物和生态体系中继Fe3+和Zn2+后的第三丰富的元素[3,4]，是人体必需的微量元素，存在于血浆铜蓝蛋白、超氧化物歧化酶、细胞色素C氧化酶，具有多种重要的生理学功能[5,6]。但是Cu2+过量摄入会破坏生物体的酶系统，阻碍生物体正常的生化反应和新陈代谢，对人体具有非常大的危害[7]。Cu2+的污染主要来源于电镀、冶金、化工等行业，而且排放到环境中的Cu2+的毒性具有持久性和生物累积性等特点[8]，对人类健康和环境安全都是一个极大的威胁。因此，使用高灵敏技术对Cu2+进行定量和快速检测显得尤为重要。

新铜试剂2，9-二甲基-邻菲罗啉(NCP)是目前常用的对Cu2+有选择性响应的显色剂[9,10]，但紫外-可见吸收光谱法与荧光法相比，其灵敏度较低。本研究基于NCP对Cu2+的优异识别能力，设计合成了Cu2+荧光探针2，9-二苯并噻唑-邻菲罗啉(PDBT)，与NCP相比，其荧光量子产率大大提高，考察了该荧光探针对Cu2+的选择性和灵敏度。该探针具有合成简单、选择性好、灵敏度高等优点，具有良好的应用前景。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4600型荧光分光光度计，UH5300型紫外-可见分光光度计(日本，日立公司)；Avance Ⅲ 400 HD型核磁共振谱仪，APEX Ⅱ型FT-ICR质谱仪(美国，布鲁克)。

2，9-二甲基-邻菲罗啉(NCP)、邻氨基苯硫酚、SeO2等均购自百灵威试剂有限公司；Na2S2O5和实验室常用试剂均购自北京化工厂。PDBT及NCP 标准溶液:分别准确称取一定量的 PDBT和NCP 溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，制成浓度为1.0×10-3mol/L 的贮备液，使用时根据需要适当稀释。金属离子标准溶液:准确称取一定量的硝酸盐溶于蒸馏水中，制成浓度为1.0×10-2mol/L的贮备液，使用时根据需要适当稀释。实验用水为蒸馏水。

1.2 实验过程

PDBT的合成路线如下所示：

1.2.12，9-二醛基邻菲罗啉中间体的合成参照文献方法[11]，称量NCP 1.04 g(5 mmol)和SeO2577 mg(5.2 mmol)加入到100 mL单口瓶中，在二氧六环-水(95∶5,V/V)的混合溶剂中搅拌回流2 h后，趁热过滤，滤液冷却至室温后有固体析出，过滤得到灰色固体1.1 g，得到2，9-二醛基邻菲罗啉粗品。

1.2.2PDBT的合成称量2，9-二醛基邻菲罗啉236 mg(1 mmol)，邻氨基苯硫酚250 mg(2 mmol)，Na2S2O5400 mg(2.1 mmol)加入到100 mL单口瓶中，加入50 mL乙醇，搅拌回流6 h。薄层层析检测反应进程，反应完全后，粗产品用二氧化硅层析柱纯化，二氯甲烷-甲醇(10∶1，V/V)洗脱，得到灰白色固体(300 mg,67.3%)。1H NMR( CDCl3,400 MHz ),δ:8.77～8.79(d，2H),8.42～8.45(d，2H)，8.18～8.20(d，2H)，8.15～8.16(d，2H)，7.91(s，2H)，7.56～7.59(t，2H)，7.49～7.53(t,2H)。MS(ESI):m/z469.1,[M+Na]+。

2 结果与讨论

2.1 PDBT在不同溶剂中的紫外-可见吸收光谱

图1A为PDBT在乙酸乙酯、乙醇、乙腈、DMF、二氯甲烷、甲醇、四氢呋喃、水中的紫外-可见吸收光谱。从图中可以看出，PDBT在上述各种有机溶剂中的吸收光谱大致相同，在310 nm波长处有较高的吸收峰，在360、380 nm处有较低的吸收峰。但是在水中，同样浓度的PDBT的吸光度明显降低，并且310、360、380 nm处的吸收峰分别红移到了320、375、395 nm，吸光度的明显降低和吸收峰的红移可能是由于PDBT分子在水中聚集引起的。

进一步考察了PDBT在不同比例DMF-水中的紫外-可见吸收光谱，从图1B中可以看到，当水含量超过50%，吸光度明显降低，超过70%后，吸光度急剧降低，其紫外-可见吸收光谱几乎没有明显的吸收峰，说明PDBT几乎全部以聚集体状态存在。

图1 PDBT(5 μmol/L)在不同溶剂(A)和在不同比例的DMF-水(B)中的吸收光谱Fig.1 Absorption spectra of 5 μmol/L PDBT in different solvents(A) and in different ratio of DMF-water(B)

2.2 PDBT在不同DMF-水比例体系中的荧光光谱研究

图2A为PDBT分子在不同比例DMF-水溶剂中的荧光强度。可以看出，在DMF中，PDBT具有较强的荧光，随着水含量的增加，荧光小幅增加，在0.4～0.5之间，荧光几乎没有变化，当超过0.5后，荧光急剧下降，当水的比例超过70%时，几乎没有荧光，这可能是因为当水的比例超过50%后，PDBT分子开始聚集，随着水含量的增加，其聚集会越来越严重，从而导致荧光猝灭，而当水超过70%后，PDBT主要以聚集体存在，荧光几乎完全猝灭，这与紫外-可见光谱研究的结果相一致(图1B)。荧光在水含量0.4～0.5之间基本持平，出现最大值.所以以下的实验均选择在DMF-水(1∶1，V/V)的体系中测试。与PDBT相比，NCP在DMF-水(1∶1，V/V)中几乎没有荧光(图2B)，经计算NCP的荧光量子产率仅为0.019(L-色氨酸为参比)，低的量子产率使之不宜用于荧光分析；而PDBT的荧光量子产率为0.135，是前者的7倍(标准物为硫酸奎宁[12])，较高的量子产率使之适用于荧光分析。

图2 (A)PDBT(5 μmol/L)在不同比例DMF-水中的荧光强度(λex:365 nm,λem:416.6 nm);(B)5 μmol/L NCP(λex:360 nm )和PDBT(λex:365 nm) 在 DMF-水(1∶1)中的荧光光谱Fig.2 (A)Fluorescence intensity of 5 μmol/L PDBT in different ratio of DMF-Water(λex:365 nm,λem:416.6 nm);(B)Fluorescence spectra of 5 μmol/L NCP(λex:360 nm ) and PDBT(λex:365 nm) in DMF-water(1∶1)

图3 不同金属离子(15 μmol/L)对PDBT(5 μmol/L)荧光强度的影响Fig.3 Effect of 15 μmol/L of different metal ions on the fluorescence intensity of 5 μmol/L PDBT

2.3 PDBT对金属离子的选择性考察

实验考察了PDBT和不同金属离子作用的荧光光谱。从图3可以看出，加入Al3+、Ba2+、Mn2+、Co2+、Cr3+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+的荧光强度和空白基本一致，再加入Cu2+都能引起荧光强度的大幅度降低，说明这些离子不干扰小分子对Cu2+的特异性识别；而Cd2+、Pb2+这两种离子能引起PDBT荧光强度的小幅度降低，但是再加入Cu2+后，可以发现荧光强度再次大幅度降低。结果表明，PDBT对Cu2+有良好的选择性。

图4 PDBT(5 μmol/L)(A)and NCP (5 μmol/L)(B)对Cu2+的荧光滴定光谱；PDBT和NCP在加入Cu2+前后的荧光强度比值(C)；PDBT对Cu2+的荧光滴定曲线和线性曲线(插图)(D)Fig.4 Fluorescence spectra of 5 μmol/L PDBT (A)and NCP(B) in the presence of different concentrations of Cu2+;Fluorescent intensity ratio of PDBT and NCP before and after addition of 15 μmol/L Cu2+ (C);Fluorescence titration curve of PDBT to Cu2+ and linear curve(inset)(D) (A) and (B):concentration of Cu2+:0,0.1,0.3,0.5,0.7,1.0,2.0,3.0,5.0,7.0,10,15,20,25,30,40,50 μmol/L.

2.4 比较PDBT和NCP对Cu2+的荧光响应

从图2B可以看出，NCP几乎没有荧光，无法进行Cu2+的荧光滴定，但为了进行比较，我们在NCP的荧光滴定实验中将狭缝宽度从2.5 nm调到10 nm。从图4A可以看到，15 μmol/L的Cu2+能将PDBT的荧光基本完全猝灭，而同浓度下的Cu2+对NCP的滴定也达到滴定终点(图4B)，但是荧光强度只猝灭了不到三分之一。采用PDBT和NCP在加入15 μmol/L的Cu2+前后的荧光强度的比值作图(图4C)，可以更清晰的看到，PDBT在加入Cu2+前后的荧光强度比值为11.2，远远大于后者的1.4，结果表明PDBT更适于Cu2+的荧光分析。

实验进而考察了检测灵敏度，PDBT对Cu2+荧光滴定的标准曲线的回归方程(见图4D的插图)为:F=1617-168.43c(μmol/L)，相关系数R2=0.9955，线性范围为0.1～7.0 μmol/L，计算得检测限为0.079 μmol/L。

图5 荧光随PDBT和Cu2+浓度变化的工作曲线Fig.5 Jobs’ plot obtained from fluorimetric analysis of mixtures of PDBT with Cu2+ [Cu2+] + [PDBT] = 10 μmol/L.

2.5 测定结合比

采用Job’s plot方法测定PDBT与Cu2+的结合比，如图5所示。由图中可以看出最大荧光强度的差值(△F)对应的横坐标约为0.5。小于0.5时，可以看出随着Cu2+的增多，△F越来越大，直至最大0.5处，大于0.5后，发现△F值随着PDBT的减小而减小，说明0.5比例处PDBT和Cu2+刚好完全络合，即PDBT与Cu2+的结合比为1∶1。

2.6 样品分析及加标回收试验

取市售的娃哈哈饮用水，按实验方法测定其荧光强度，并进行加标回收试验，结果如表1，回收率在95.2%～99.75%之间，良好的回收率说明其有望适用于实际样品中Cu2+的检测。

表1 回收率试验

3 结论

基于NCP对Cu2+的良好识别能力，设计合成了荧光探针PDBT，其荧光量子产率为0.135，是NCP的7倍。该探针对Cu2+有良好的选择性和较高的灵敏度，检测限低至0.079 μmol/L，Job’s plot研究表明PDBT与Cu2+是1∶1结合。对市售饮用水进行加标回收实验，得到了良好的回收率，说明其有望用于实际样品中Cu2+的检测。