基于非线性化学指纹图谱技术测定婴幼儿羊奶粉中掺假牛奶粉含量

马永杰， 董文宾， 樊 成， 方 悦， 王世鹏

(1.陕西科技大学化学与化工学院,陕西西安 710021；2.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安 710021；3.陕西省产品质量监督检验研究所，陕西西安 710048)

婴幼儿羊奶粉是一种高营养的食品，其价格普遍高于牛奶粉。由于奶粉加工配方、工艺和设备不同，奶粉的颗粒大小、颜色等物理性质和化学组成差异较大[1]，故在外观及形态上很难对掺假配方奶粉进行真伪辨别。目前，针对原料乳羊奶中掺有牛奶或其它物质的检测方法主要有色谱指纹图谱[2]、光谱指纹图谱[3]、毛细管电泳技术[4]和酶联免疫分析法[5]等。奶的成分较复杂，仅测定样品中的一种或多种成分对奶及其制品进行鉴别和评价，具有一定的局限性。而指纹图谱技术分析成本较高且操作流程较长。因此，探索一种无需分离和提纯的指纹图谱技术，对奶及其制品的掺假进行鉴别和评估是非常有必要的。

B-Z(Belousov & Zhabotinsky)振荡反应的发现促使人们开始对非线性化学反应现象进行研究[6]。对于非线性化学的反应机理[7 - 9]和应用[10,11]，已经进行了较为广泛而深入的研究，并报道了许多研究成果[12,13]。目前，利用非线性化学群集成分分析方法对原料乳羊乳中同时掺杂牛乳和马乳的检测，已经取得了很满意的效果。所谓群集成分分析是指由多种成分，包括多种单一成分和类成分组成的复杂体系中各成分子集的分析[14]。对于婴幼儿配方羊奶粉中掺杂牛奶粉的检测分析也属于群集成分分析的范畴。基于电子鼻技术对羊奶粉中掺假牛奶粉的快速检测方法已有报道[15]，但利用非线性化学指纹图谱技术对婴幼儿配方羊奶粉中掺假婴幼儿配方牛奶粉的定性判别和定量分析鲜有研究报道。

本研究基于“H2SO4-丙酮-NaBrO3-MnSO4-标样成分”振荡体系，采用非线性化学指纹图谱技术群集成分分析方法，利用最小二乘一元线性回归法建立特征参数与掺杂奶粉含量的定量评价模型，对婴幼儿配方羊奶粉中掺杂的婴幼儿配方牛奶粉进行定量分析和质量评价，以此评估应用非线性化学指纹图谱技术在婴幼儿配方羊奶粉掺假检测中的可行性。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂和样品

MZ-1B-2型非线性化学指纹图谱测定仪(湖南尚泰测控科技有限公司生产)；217型复合甘汞电极和213型金属铂电极(上海精密科学仪器有限公司)；BS 224 S电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

1.00 mol/L H2SO4，1.00 mol/L丙酮，0.80 mol/L NaBrO3溶液，0.08 mol/L MnSO4溶液。以上试剂均为分析纯。水为二次蒸馏水。

所用某品牌婴幼儿配方羊奶粉(简称奶粉Ⅰ)及某品牌婴幼儿配方牛奶粉(简称奶粉Ⅱ)均由陕西省产品质量监督检验研究所提供。奶粉标准样品配制：取5份奶粉Ⅰ，分别加入0、10%、20%、40%、60%的奶粉Ⅱ，配成混合奶粉，每份标样的总量为0.85 g。

1.2 实验方法

1.2.1标样定量信息测定与回归方程模型建立取0.85 g上述奶粉标样于反应器中，依次加入25.00 mL H2SO4，12.00 mL丙酮，15.00 mL MnSO4溶液和10.00 mL水。盖好带注射孔和电极的反应器盖，打开恒温系统调节反应器，温度设为50 ℃，恒速搅拌设定800 r/min，点击菜单采集数据，搅拌到3.00 min时用注射器迅速加入5.00 mL NaBrO3溶液。记录E-t曲线至电位E不再随时间t变化为止。利用Matlab软件确定所测混合奶粉指纹图谱的停波时间，采用最小二乘一元线性回归法来建立停波时间与掺杂奶粉Ⅱ含量的定量评价模型。

1.2.2未知试样的测定准确称取0.85 g奶粉样品，采用1.2.1方法，测定指纹图谱，利用Matlab软件确定所测奶粉指纹图谱的停波时间，通过回归方程计算混合奶粉中掺杂奶粉Ⅱ含量。

2 结果与讨论

2.1 反应体系中各物质及其浓度对非线性化学指纹图谱的影响

影响非线性化学指纹图谱特征信息的物质主要有四类[16]，分别为反应底物、反应耗散物、共存物质，以及存在于体系中但并不参与任何化学反应的物质。在反应体系中各种反应物与其浓度的改变，将导致整个E-t关系式发生改变，如在H2SO4-丙酮-NaBrO3-MnSO4体系中，采用非线性化学指纹图谱测定奶粉Ⅱ的指纹图谱的可量化信息如表1。由表1可知，体系中各物质的浓度变化对指纹图谱可量化参数具有不同程度的影响。由图1可知，每种样本指纹图谱的形成并非只是由于某种或某些非线性化学反应底物(包括耗散物)的作用，而是体系中所有共存物质不同程度作用的结果，这些共存物质对由底物引起的非线性化学反应都有不同的影响。因此，非线性化学指纹图谱特征信息是体系中各物质不同程度共同作用的结果，反映的是样品中各物质的群集特征。

表1 体系中反应试剂的加入量对奶粉Ⅱ非线性化学指纹图谱定量信息的影响

图1 奶粉Ⅰ(a)和奶粉Ⅱ(b)的非线性化学指纹图谱Fig.1 The nonlinear chemical fingerprints of milk powderⅠand milk powderⅡ the detecting dosage:0.9005 g.

2.2 奶粉指纹图谱的基本信息和重现性

图2 奶粉Ⅰ非线性化学指纹图谱的基本特征信息Fig.2 Basic characteristic information of nonlinear chemical fingerprint of milk powderⅠ e-f:inductive curve;f-g:fluctuation curve;g-h:stop wave curve;e and h are the start and end points of reaction,respectively.

非线性化学指纹图谱拥有丰富的直观信息和可量化信息，其直观信息中包含诱导曲线、波动曲线、波峰形状和电位漂移曲线等。可量化信息即特征参数包含峰谷电位(Ecan)、峰谷时间(tcan)、峰顶电位(Epet)、峰顶时间(tpet)、诱导时间(tind)、起波电位(Euns)、停波电位(Eune)、停波时间(tune)、平衡电位(Eequ)、平衡时间(tequ)、波动幅度(△Eund)、最大波幅(△Emax)、波动寿命(tund)、波动周期(τund)和波数(nwav)等[6,17]。如奶粉Ⅰ的非线性化学指纹图谱的相关特征信息见图2。

按实验方法测定了奶粉Ⅰ和奶粉Ⅱ的非线性化学指纹图谱，各样本平行测定3次。图3表明，各种奶粉非线性化学指纹图谱均有很好的特征性和重现性。不同品牌不同种类的奶粉因其成分的种类和浓度差异，其指纹图谱表现出相应的差异。从图3(c)可知，奶粉Ⅰ指纹图谱的诱导时间长，停波时间较短，诱导曲线轮廓左端基本没有下凹现象；相比较而言，奶粉Ⅱ指纹图谱的诱导时间较短，停波时间较长，诱导曲线轮廓左端下凹的趋势幅度较大。因此，直接利用这些指纹图谱明显的直观特征差异就可将奶粉Ⅰ和奶粉Ⅱ区别开。

图3 奶粉Ⅰ(a)和奶粉Ⅱ(b)的非线性化学指纹图谱的重现性和特征差异 Fig.3 Reproducibility and characteristic difference of nonlinear chemical fingerprints of milk powder Ⅰ(a) and milk powder Ⅱ(b) a,b:1,2 and 3-parallel determination number;c:1-infant formula milk powderⅠ,2-infant formula goat milk powderⅡ.

2.3 奶粉掺杂定量测定方法研究

不同品牌婴幼儿配方羊奶粉和牛奶粉的纯品指纹图谱的特征各不相同，差异性明显。当奶粉Ⅰ和奶粉Ⅱ互掺时，其混合奶粉指纹图谱特征与各种纯品的特征也明显不同。为此，本文以奶粉Ⅰ为主，分别向其中掺杂不同百分含量的奶粉Ⅱ，测定混合奶粉的指纹图谱，利用这些指纹图谱的特征参数如停波时间与混合奶粉中掺杂量之间的线性回归关系模型，对相应奶粉进行鉴别和掺杂含量的定量评价。

2.3.1掺假的混合奶粉指纹图谱信息定量鉴别和评价模型的建立分别取0.85 g奶粉标样5份，按1.2.1方法测定其指纹图谱。其中奶粉Ⅱ的含量对非线性化学指纹图谱的影响见图4。由图4可知，奶粉标样中的奶粉Ⅱ的含量对指纹图谱的定量信息停波时间有规律性影响，呈良好的线性关系。本研究采用最小二乘一元线性回归法，根据掺杂奶粉非线性化学指纹图谱的定量参数信息停波时间(tune)与奶粉Ⅱ掺杂量(c)的线性关系,拟合出相应的定量鉴定评价模型，如图4(b)所示。

图4 奶粉Ⅱ的含量对非线性化学指纹图谱(a)和停波时间(b)的影响 Fig.4 Influence of the content of milk powderⅡ on characteristic information of nonlinear chemical fingerprint(a) and the stop wave time(b)a:1：0%，2：10%，3：20%，4：40%，5：60%.

2.3.2用定量鉴别和评价模型预测混合奶粉中掺杂奶粉含量为了验证实验的可行性以及可靠性，测定了奶粉Ⅰ与奶粉Ⅱ按不同比例混合的奶粉以及奶粉Ⅰ的指纹图谱，通过图4(b)中相应的拟合方程，求出相应奶粉中掺杂的奶粉Ⅱ含量。测定结果及其精密度和准确度见表2。由表2中数据可见，各种混合奶粉中掺杂含量测定结果的相对标准偏差(RSD)≤2.18%，回收率在95.3%～107.0%之间。

表2 非线性化学指纹图谱法测定奶粉Ⅰ中掺杂奶粉Ⅱ含量与定量鉴定和评价结果(n=3)

3 结论

本文利用非线性化学指纹图谱技术对婴幼儿配方羊奶粉中掺杂牛奶粉的含量进行定量分析，实验结果表明，采用非线性化学指纹图谱技术群集成分分析方法，对婴幼儿配方羊奶粉中掺杂的牛奶粉进行定量分析和质量评价，其方法可行，分析结果具有较高的精密度和准确度。提出的方法不仅可用于准确鉴别同品牌不同批次的婴幼儿配方羊奶粉中掺入牛奶粉的含量，而且还可以用于复杂样品中其它物质含量的测定。该方法具有操作简单和分析成本低廉的优点，同时对食品掺杂及打假防伪具有重要作用。