反相高效液相色谱法测定对虾组织中噁喹酸残留

2016-10-15殷桂芳房文红沈锦玉陈进军

分析科学学报 2016年2期

殷桂芳，王元，房文红*，沈锦玉，陈进军

(1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；3.浙江省淡水水产研究所，浙江湖州 313001)

噁喹酸(Oxolinic Acid，OA)是喹诺酮类的第二代广谱杀菌药，通过干扰细菌DNA螺旋酶从而影响细菌染色体超螺旋而达到杀菌作用[1]。噁喹酸是我国国家标准渔药中的抗菌药物之一[2]，广泛用于防治鱼类系统性细菌性疾病[3]，尤其是海水养殖动物弧菌病[4,5]。我国目前没有规定养殖虾中噁喹酸最高残留限量(MRL)，仅规定了鱼(肌肉和皮)的MRL为300 μg·kg-1[6]。欧盟畜禽兽医残留限量标准也仅是规定了鱼(肌肉和皮)的MRL为100 μg·kg-1[7]，而日本肯定列表中规定了虾产品中噁喹酸的MRL为30 μg·kg-1[8]。有关生物样品中噁喹酸的测定方法己有报道[9 - 14]，但大多集中在鱼类。

我国水产养殖动物种类繁多，不同水产动物采用同一种方法具有局限性。本研究优化了检测波长、流动相和生物样品提取方法，建立了对虾血淋巴、肌肉、肝胰腺和鳃等组织中噁喹酸的反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定方法，为对虾药代动力学研究和药物残留检测奠定了技术基础。

1 实验部分

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2475荧光检测器；Millipore Milli-Q Advantage超纯水仪；Bertin precellys 240均质器；Eppendorf微量移液器；Hitachi CF16RⅡ高速冷冻离心机；亚荣RE-52A旋转蒸发仪；Rephile 0.22 μm微孔滤膜。

1.2 试剂和试验材料

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)为东海水产研究所海南琼海研究中心室内池养殖，海水盐度33，水温30 ℃±1 ℃，保持24 h充气，投喂不含噁喹酸的对虾全价饲料，无噁喹酸使用记录。挑选健康、体长9.0±0.5 cm用于试验。

噁喹酸标准贮备溶液：准确称取0.0100 g噁喹酸标准品(纯度≥98.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)于50 mL烧杯中，加0.5 mol·L-1NaOH溶液200 μL溶解，甲醇定容至100 mL，浓度100 μg·mL-1，4 ℃保存。噁喹酸原粉(纯度≥98.0%)购于潍坊三江医药集团。甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷均为色谱纯(德国Merck公司)；四丁基溴化铵、磷酸、甲酸和草酸均为分析纯(国药集团上海化学试剂公司)。

1.3 色谱条件

色谱柱为Aglient Zorbax SB-C18柱(150×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.01 mol·L-1四丁基溴化铵(磷酸调节pH为2.75)，流速1.0 mL·min-1；柱温40 ℃；进样量10 μL，荧光检测器λex=265 nm、λem=380 nm。为使药峰和杂峰更好分开，分离不同组织样品时流动相比例有所不同，血浆和肌肉的流动相比例为25∶75(V/V);肝胰腺和鳃的流动相比例为18∶82(V/V)。

1.4 样品前处理

1.4.1血淋巴样品取出样品，于室温融解后，1 000 r·min-1离心5 min，取0.2 mL上清液于1.5 mL离心管中，加入等体积乙腈，涡旋振荡2 min，12 000 r·min-1离心5 min，取上清液经微孔滤膜过滤，滤液用于HPLC分析。

1.4.2肌肉、肝胰腺和鳃样品样品于室温解冻后，取适量于均质器中均质。准确称取均质后样品(肌肉1.00 g、肝胰腺和鳃0.50 g)于10 mL离心管中，加入1 mL 0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)，旋涡振荡器上振荡2 min，加入5 mL乙腈，继续振荡5 min，于10 000 r·min-1离心5 min，收集上清液；残渣再重复提取两次，合并三次上清液于100 mL具塞茄形蒸发瓶中，于45 ℃旋蒸至近干；加入1 mL流动相和1 mL正己烷，超声15 min，至瓶底残留物完全溶解，将混合液体转移至2 mL离心管中，12 000 r·min-1离心5 min，吸取下层液体，经0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液用于HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1检测波长选择合适的激发波长和发射波长，对荧光检测的灵敏度和选择性都很重要。实验比较了λex/λem=265/380 nm、λex/λem=312/369 nm和λex/λem=327/369 nm 3组检测波长下的目标物的峰宽、峰高和峰面积。结果表明采用λex/λem=265/380 nm时峰高和峰面积最大，在该组波长下峰形和灵敏度都得到了提高。

2.1.2流动相比较不同流动相条件下噁喹酸的色谱行为，5种流动相分别为乙腈∶四氢呋喃∶0.02 mol·L-1磷酸=16∶15∶69(V/V/V)[9]、乙腈∶0.01 mol·L-1草酸=35∶65(V/V)[12]、乙腈∶0.01 mol·L-1草酸∶甲醇=30∶60∶10(V/V)[11]、乙腈∶0.1%甲酸=60∶40[10]和乙腈∶0.01 mol·L-1四丁基溴化铵=25∶75(V/V)[15]，对文献中的流动相比例做了适当调整。比较1 μg·g-1浓度添加噁喹酸的对虾肌肉样品在5种流动相条件下的色谱行为，其峰宽、峰高和峰面积见表1。综合考虑峰宽、峰高及杂峰干扰，最终确定检测肌肉和血淋巴样品的流动相为：乙腈∶0.01 mol·L-1四丁基溴化铵(磷酸调节pH为2.75)=25∶75(V/V)，保留时间为6.18 min(图1A、B)；因肝胰腺和鳃样品中内源性物质干扰，为使目标峰和杂质峰更好分开，将流动

表1 不同流动相下噁喹酸药峰峰宽、峰高和峰面积(n=3)

相比例调整为18∶82(V/V)，保留时间在12.82 min(图1C、D)。

2.2 提取液的选择

实验比较了不同提取液提取肌肉中噁喹酸的回收率(表2)，4种提取液分别为乙腈[12]、酸化乙腈(1%乙酸乙腈)[10]、乙酸乙酯[9,11]和二氯甲烷[13,14]。不同提取液对肌肉提取效果不同，乙腈提取效果最好，其次为酸化乙腈，再次为乙酸乙酯，二氯甲烷最差。二氯甲烷加入后，肌肉凝固变为较致密的一团难以分散，阻碍了噁喹酸的提取，从而导致回收率最低。

表2 不同提取液提取肌肉中添加噁喹酸的回收率

2.3 标准曲线及检测限

应用优化的实验条件，建立噁喹酸标准曲线，在0.002～10 μg·mL-1范围内标准曲线线性关系良好。检测血浆和肌肉组织样品采用的标准曲线为：y=242.51x-5.03(R2=0.9996)，检测肝胰腺和鳃组织样品采用的标准曲线为：y=209.52x-4.03(R2=0.9999)。对虾血淋巴、肌肉、肝胰腺和鳃加标后噁喹酸定量限分别为0.02 μg·mL-1、0.01 μg·g-1、0.02 μg·g-1和0.02 μg·g-1。

2.4 回收率及精密度

采用标准加入法测定对虾血淋巴、肌肉、肝胰腺和鳃中噁喹酸回收率，每个浓度做3个平行，按“样品前处理”方法处理，采用HPLC测定，测得各组织回收率结果如表3所示。可以看出，各组织的噁喹酸回收率都较高，均在80%以上；通过精密度试验，得出对虾血淋巴、肌肉、肝胰腺和鳃中的日内精密度分别为：2.75%、1.60%、2.81%和4.02%，日间精密度分别为:2.91%、3.85%、4.73%和4.49%。