基于代谢组学研究橙黄决明素对高脂血症大鼠的调脂作用

2016-10-15戴迎春

分析科学学报 2016年2期

余胜，邓楠，刘文，戴迎春，张惠

(1.湖南省人民医院药学部，湖南长沙 410005；2.湖南师范大学医学院，湖南长沙 410006)

高血脂症是由于脂肪代谢或运转异常使血浆一种或多种脂质高于正常值而引起的疾病，为动脉粥样硬化的主要发病因素，常因危害重要器官而引起严重后果，如冠心病、脑血管意外等。目前临床上广泛应用他汀类药物来治疗高血脂症并预防心脑血管意外事件，疗效较显著。但长期或大剂量使用他汀类药物可能会导致心脏横纹肌溶解、肝脏组织细胞生物化学变化等严重不良反应[1 - 3]。因此，研究和开发安全、有效的新型降血脂药物十分重要。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一门关于生物体内源代谢物质种类、数量及其变化规律的学科[4]。近年来，代谢组学已被成功的应用于高血脂症的研究，为高血脂症的诊断和治疗提供了有效帮助[5 - 7]。

决明子作为一种常见的中药材，长期临床应用表明其降脂作用明确，疗效可靠，副作用少，但与其他传统中药一样，存在着成分复杂、机理不十分清楚等缺点[8 - 10]。已有研究报道，橙黄决明素是决明子降脂作用的有效活性成分[11]。在前人研究的基础上，本文运用代谢组学方法考察橙黄决明素对高脂血症的逆转程度及调控作用，为新型调脂药物的研发及临床应用提供可靠的理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Beckman AU5821全自动生化分析仪(美国，贝克曼公司)；WH-2微型旋涡混合器(上海沪西分析仪器厂有限公司)；TGL-16高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；GCMS-QP2010气-质联用仪(日本，岛津公司)；岛津DB-5熔融石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

胆固醇(北京乐博生物科技有限公司)；胆盐、蛋黄粉(北京奥博星生物技术有限责任公司)；甲硫氧嘧啶(天津市博迪化工有限公司)；橙黄决明素(四川维克奇生物科技有限公司)；2-异丙基苹果酸(Sigma公司)。总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-c)测定试剂盒，均由北京九强生物技术有限公司提供。

1.2 实验动物

SD雄性大鼠30只，体重180～220 g，购于斯莱克景达实验动物有限公司(许可证号：SCXK(湘)2013-0004)，饲养于湖南省人民医院实验动物中心动物实验室。

1.3 高血脂症大鼠造模及取样

采用文献中高脂饲料造模方法[12]，将大鼠随机分成2组，正常对照组(10只)：普通饲料喂养；高血脂症模型组(20只)：高脂饲料(蛋黄粉8%、猪油6%、胆固醇4%、胆酸钠0.5%、丙硫氧嘧啶0.2%、基础饲料81.3%)喂养。30 d后眼底静脉丛取血检测其生化指标，确认造模效果。造模过程中高血脂症模型组死亡4只，将余下的16只平均随机分成2组，分别为模型组和橙黄决明素组，于造模成功后，橙黄决明素组灌胃橙黄决明素3.6 mg/(kg·d)，正常组和模型组则给予等量安慰剂(羧甲基纤维素钠)。治疗30 d后眼底静脉丛取血，12 000 r/min离心10 min(4 ℃)，取血浆于-20 ℃下保存，用于GC-MS检测。

1.4 生化指标分析

取100 μL血浆样本，利用Beckman AU5821全自动生化分析仪，分别逐次测出每个样本的LDL-c、TG、TC、HDL-c值等参数，并获取进行自动分析后的数据值。

1.5 样品预处理与GC-MS分析

结合石书婷等[13]的研究进一步优化样品前处理方法。取100 μL血浆样本置于1.5 mL离心管中，加入10 μL 2-异丙基苹果酸/甲醇溶液(内标，1 mg/mL)，涡旋15 s，再加入300 μL甲醇沉淀蛋白，涡旋15 s，离心10 min(4 ℃，12 000 r/min)，取上清液置于离心管，常温下氮气吹干，加入50 μL甲氧胺吡啶溶液(15 mg/mL)，涡旋30 s后，70 ℃水浴肟化1 h，再加入100 μL硅烷化试剂N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，内含1% TMCS)，涡旋10 s，70 ℃水浴1 h，冷却至室温，取100 μL于微量进样管中用于GC-MS进样分析，进样量1 μL。

GC-MS分析条件：进样口温度280 ℃，初始柱温70 ℃，保持4 min，以8 ℃/min速度升温至300 ℃，保持3 min；接口温度250 ℃；离子源温度200 ℃；氦气作为载气，流速1 mL/min，分流比10∶1，全扫描35～850m/z；溶剂切除时间6.5 min。

1.6 数据处理

生化指标结果采用SPSS 13.0统计软件进行统计，数据以均数±标准偏差(mean±SD)表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。使用岛津色谱工作站对GC-MS总离子流图中各种代谢物的峰面积进行积分，利用NIST107和NIST05数据库对血浆中的代谢物进行鉴定，以相对峰面积(与内标峰的比值)表示代谢物的含量，得到GC-MS数据。各组灌胃给药前后的代谢物谱数据利用主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS -DA)和随机森林算法(RF)进行处理。

2 结果与讨论

2.1 生化指标分析

表1列出了造模前后生化指标值的比较关系。正常组在造模前后TC与LDL-c的变化不明显(P>0.05)，而模型组在造模前后TC与LDL-c的变化体现了显著性升高(P<0.01)，表明造模成功。

表1 大鼠造模前后血脂指标

2.2 GC-MS数据分析和生物标志物的鉴定

经GC-MS法测定，大鼠血浆的总离子流色谱图(TIC)，如图1所示。结果表明，大鼠血浆中有47种内源性代谢物(去除内标，同时合并重复出现的峰)，结果见表2。

2.3 多元统计分析

表2 GC-MS检测到的大鼠血浆内源性代谢物

* Identified by standard substances,**Internal standard.

2.3.2PLS-DA结果相对于PCA，PLS-DA以预测均方根误差为回归目标，能使得预测结果的均方根误差更小，更具可靠性[14]。运用SIMCA-P 11.0软件对大鼠血浆内源性代谢物进行PLS-DA分析，结果如图3所示。可以看到正常组与模型组在空间中得到了完全分离，橙黄决明素组向正常组靠近，证明橙黄决明素具有较佳的调脂效果。由于PLS-DA易产生过拟合现象[15]，为消除其影响，本工作采用随机森林分析法作进一步研究。

2.3.3RF结果RF是一种基于决策树的组合分类器，具有不易过拟合，预测较准确等优点，同时对变量间的非线性关系和交互作用可更有效识别[16]。运用MATLAB软件，并设定参数为(mtree=1 000；ntree=1 000)对大鼠血浆内源性代谢物进行RF分析，得到投影图和回归系数图(图4)。从图4(a)可以看出，模型组与正常组完全分离，橙黄决明素组远离模型组，向正常组靠近，表明橙黄决明素调脂效果明显。从图4(b)得到造模前后大鼠血浆中内源性代谢物变化最显著的10种，即为潜在的生物标志物：丙氨酸、甘氨酸、L-缬氨酸、异亮氨酸、富马酸、丝氨酸、1,5-脱水山梨醇、亚油酸、硬脂酸和胆固醇。高脂饲料造模的过程中，大鼠血浆中甘氨酸、丝氨酸、硬脂酸及胆固醇含量上升，丙氨酸、L-缬氨酸、异亮氨酸、富马酸、1,5-脱水山梨醇及亚油酸则下降，与已有报道基本符合[17]；再比较高血脂症模型组与橙黄决明素灌胃治疗30 d后大鼠血浆内源性代谢物的变化，得到10种变化最大的代谢物：丙氨酸、甘氨酸、L-缬氨酸、尿素、异亮氨酸、富马酸、丝氨酸、苯丙氨酸、硬脂酸和胆固醇，与造模前后得到的高血脂症生物标志物相比，橙黄决明素治疗后，大部分代谢物变化得到回调，另外增加了对尿素和苯丙氨酸的影响。说明橙黄决明素主要通过调整体内部分氨基酸及游离脂肪酸而起到调脂作用。