杂交鹅掌楸总黄酮检测及DPPH自由基清除作用

姚文红 李飞阳 孙立梅 张林超

摘要：本研究通过AlCl3-NaAc显色体系，采用分光光度法测定杂交鹅掌楸树叶中总黄酮含量，并与其它部位含量及其DPPH自由基清除能力进行比较分析。结果表明，该方法的最佳测定波长为272 nm，最佳测定时间范围为显色后30～80 min内，精密度RSD=0.56%（n=5），回收率为103.64%（RSD=2.05%），该测定方法准确可靠，利用该法测得杂交鹅掌楸树叶总黄酮含量为4.67%（RSD=2.01%，n=5），明显高于其它部位；不同部位提取的黄酮类化合物对DPPH自由基的清除能力由高到低为：树根>树叶>树皮>花>叶柄>树枝，IC50值依次为：6.65、9.88、10.25、15.55、19.71、24.15 μg/mL。杂交鹅掌楸树叶中总黄酮含量较高，抗氧化性较强，具有开发利用的潜在价值。

关键词：杂交鹅掌楸；总黄酮；含量检测；DPPH自由基清除能力

中图分类号：S792.210.8文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）09-0127-05

AbstractThe total flavonoids in Liriodendron hybrid leaves were determined by spectrophotometry using AlCl3-NaAc chromogenic system. Their contents and DPPH radical scavenging ability were compared with those in other parts. The results showed that the optimum wavelength was 272 nm for determination of total flavonoids in Liriodendron hybrid leaves. The optimal determination time was in 30～80 minutes after color development. The relative standard deviation （RSD） of precision test was 0.56% （n=5）， and the average recovery rate was 103.64% （RSD=2.05%）， so this method was accurity and reliable. Using this method， the contents of total flavonoids in Liriodendron hybrid leaves was 4.67% （RSD=2.01%， n=5）， which was obviously higher than those of any other parts. The ability of scavenging DPPH radical of total flavonoids from different parts was in the order of root>leaf>bark>flower>petiole>branches with the IC50 as 6.65， 9.88， 10.25， 15.55， 19.71 and 24.15 μg/mL respectively. In conclusion， the content of total flavonoids in Liriodendron hybrid leaves was significantly higher with stronger antioxidant activity， so it had potential value of development and utilization.

KeywordsLiriodendron hybrid； Total flavonoids； Content determination； DPPH radical scavenging ability

鵝掌楸Liriodendron chinense（Hemsl.）Sarg.为木兰科鹅掌楸属落叶大乔木[1]，是第四纪冰川期孑遗植物，主要分布于我国南方和美国东南部，分别被称为鹅掌楸和北美鹅掌楸。20世纪70年代，我国著名育种学家叶培忠教授将两者杂交，培育出杂交鹅掌楸。《全国中草药汇编》中记载，鹅掌楸夏秋采树皮，秋采根，晒干入药，可治疗风湿关节痛、风寒咳嗽等症[2]，但是采剥树皮和挖掘树根，会影响鹅掌楸的正常生长，甚至导致其死亡。研究表明，鹅掌楸树叶提取物对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和粪链球菌有明显的抑菌效果[3]，提取鹅掌楸落叶中有效成分，发掘其潜在医药用途，对保护好来之不易的古树名木绿化成果具有重要意义。

本试验首次对杂交鹅掌楸树叶中总黄酮含量进行了检测，并与树皮、树根、树枝、花等部位总黄酮含量进行了比较，在此基础上，进一步对各部位所含黄酮类化合物的DPPH自由基清除能力进行了比较，以期为杂交鹅掌楸药用成分的开发提供理论参考。

1材料与方法

1.1试验材料

杂交鹅掌楸树叶、树皮、树根、花、叶柄、树枝，采集于青岛农业大学校区内并由农学与植物保护学院实验室鉴定；芦丁标准品（国药集团化学试剂有限公司）；DPPH（WAKO公司）；其它试剂均为分析纯；试验用水为二次蒸馏水。

UV-1601型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；电热恒温水浴锅（龙口市先科仪器有限公司）；BHG-9070AS型电热恒温鼓风干燥箱（金坛市荣华仪器制造有限公司）；AR1140型电子天平（上海奥豪斯国际贸易有限公司）；SF-170型高速粉碎机（上海中药机械厂）。

1.2试验方法

1.2.1杂交鹅掌楸树叶总黄酮提取参考文献[4]方法，将洗净晾干后的杂交鹅掌楸树叶粉碎，过80目筛后用石油醚浸泡48 h，去除脂溶性色素，干燥后即制得样品。准确称取样品0.5000 g，按质量体积比1∶35比例加入60%乙醇17.50 mL，85℃恒温水浴回流提取60 min，冷却至室温后过滤，定容至100 mL，制得样品液。

1.2.2杂交鹅掌楸树叶总黄酮含量测定测定波长选择：准确称取60℃恒温干燥至恒重的蘆丁标准品25.4 mg，加入60%乙醇适量，微热溶解，冷却后定容至250 mL，制得浓度为0.1016 mg/mL标准液。准确移取样品液、标准液2.00 mL，分别加入0.1 mol/L氯化铝2.00 mL、1.0 mol/L乙酸钠3.00 mL，60%乙醇定容至25 mL，充分混合后放置30 min，在200～500 nm波长范围内进行紫外可见吸收光谱扫描[5]，确定最佳测定波长。

标准曲线制作：准确移取标准液0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00、5.50、6.00、7.00、8.00 mL，按照测定波长选择中的方法，加入显色剂，于272 nm测定吸光度，制作标准曲线[6]，标准液浓度c对吸光度A线性回归方程为A=0.005760+38.949c，R=0.9997，标准品在0～32.00 μg/mL范围内，线性关系良好。

稳定性试验：准确移取样品液1.00 mL，按照标准曲线制作中的方法，室温下，每隔一段时间测定一次吸光度，连续记录90 min，平行3次，寻找样品液显色络合物吸光度最稳定的时间范围。

精密度试验：准确移取样品液1.00 mL，按照标准曲线制作中的方法，测定吸光度，平行5次，计算RSD。

加标回收率试验：按照表2所示，准确加入样品液和标准液，按照标准曲线制作中的方法，测定吸光度，计算加标回收率。

重复性试验：按照1.2.1中样品液制备方法进行操作，平行5次，得到5份提取液，分别准确移取每份提取液1.00 mL，按照标准曲线制作中的方法，测定吸光度，平行3次，依据下式计算杂交鹅掌楸树叶中总黄酮含量。

总黄酮含量（%） =[（A-0.05760）×25×100]/（38.949×1000×m）×100

式中：A为吸光度，m为样品质量（g）。

1.2.3杂交鹅掌楸不同部位总黄酮含量测定按照1.2.1中方法提取杂交鹅掌楸的花、树皮、树根、叶柄、树枝中黄酮类化合物，得到不同部位总黄酮提取液。准确移取提取液1.00 mL，采用测定波长选择中的方法，进行显色反应，于250～500 nm波长范围内进行紫外可见光谱扫描；于272 nm测定每种提取液吸光度，平行3次，计算杂交鹅掌楸不同部位总黄酮含量[7]。

1.2.4DPPH自由基清除率的测定将杂交鹅掌楸不同部位提取液分别进行旋蒸，得到浓缩液，加入适量蒸馏水，配成总黄酮浓度为50 μg/mL的待测液。准确移取待测液0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 mL于比色管中，60%乙醇补至5.00 mL，摇匀，分别加入0.2 mmoL/L的DPPH试剂5.00 mL，充分混合均匀，置于暗处反应30 min后，于517 nm测定吸光度[8，9]，计算清除率。

DPPH自由基清除率（%）=[A对照-（A样品-A空白）]/A对照×100

式中：A对照为60%乙醇与DPPH试剂混合液吸光度；A样品为待测液与DPPH试剂混合液吸光度；A空白为待测液与60%乙醇混合液吸光度。

同上述操作，测定同浓度VC、BHT溶液对DPPH自由基清除作用，与杂交鹅掌楸不同部位待测液进行比较。

2结果与分析

2.1杂交鹅掌楸树叶总黄酮含量测定

2.1.1测定波长选择由图1可知，样品液与标准液显色扫描图谱图形走势相似，均有三个明显吸收峰。与标准液相比，样品液在200～250 nm之间吸收峰发生红移，350～500 nm之间最大吸收波长发生35 nm蓝移，只有250～300 nm之间吸收峰与标准品一致，因此选择最大吸收波长272 nm为测定波长，测定杂交鹅掌楸叶总黄酮含量。

紫外可见扫描图谱

2.1.2稳定性试验图2显示，开始阶段，由于生成的显色络合物不够稳定，所测吸光度值偏小，30 min后，吸光度趋于稳定，在30～80 min范围内，尽管示值有所变化，但在0.3606～0.3659之间波动（RSD=0.54%），变化很小，说明杂交鹅掌楸叶中黄酮类化合物的显色络合物十分稳定，所测吸光度符合定量分析要求，因此显色反应30～80 min后为最佳测定时间。

2.1.3精密度试验由表1可知，采用该方法测定杂交鹅掌楸树叶总黄酮含量，精密度RSD=0.56%<2.00%（n=5），该测定方法准确可行。

杂交鹅掌楸不同部位总黄酮对DPPH自由基清除作用参考文献[10，11]分析方法，总黄酮浓度相同条件下，杂交鹅掌楸不同部位提取的待测液与VC、BHT对DPPH自由基清除率的结果。

在总黄酮浓度0～25.00 μg/mL测定范围内，杂交鹅掌楸树根部总黄酮对DPPH自由基清除能力最强，总黄酮浓度（c）与清除率（y）呈现对数关系，树叶和树皮部位的总黄酮DPPH自由基清除能力基本一致，这三个部位提取的总黄酮清除能力均强于BHT，弱于VC；花、叶柄、树枝提取的总黄酮DPPH自由基清除能力相对较弱。

杂交鹅掌楸不同部位提取的总黄酮，对DPPH自由基清除能力由高到低的顺序为：树根>树叶>树皮>花>叶柄>树枝，半数清除率IC50值依次为：6.65、9.88、10.25、15.55、19.71、24.15 μg/mL（VC、BHT的IC50值分别为：5.47、12.37 μg/mL）。由此可见，杂交鹅掌楸树叶中黄酮类化合物具备较强的DPPH自由基清除能力。

3讨论与结论

本研究通过AlCl3-NaAc显色体系，采用分光光度法测定了杂交鹅掌楸不同部位的总黄酮含量，该测定方法操作简单，稳定性良好，回收率和精密度均达到测定要求。结果表明，杂交鹅掌楸树叶、花、树皮、树根、叶柄、树枝中总黄酮含量分别为：4.67%、3.11%、2.91%、1.72%、1.45%、1.18%，其中树叶中总黄酮含量明显高于其它部位。

杂交鹅掌楸不同部位提取液对DPPH自由基清除能力由高到低的顺序为：树根>树叶>树皮>花>叶柄>树枝，半数清除率IC50值依次为：6.65、9.88、10.25、15.55、19.71、24.15 μg/mL（VC、BHT的IC50值分别为：5.47、12.37 μg/mL），杂交鹅掌楸树叶中黄酮类化合物具备较强的DPPH自由基清除能力。