从转基因技术角度谈转基因植物的安全性

叶兴国　杜丽璞

从转基因技术角度谈转基因植物的安全性

叶兴国杜丽璞

（中国农业科学院作物科学研究所，北京100081）

目前，将外源基因转入植物的方法主要包括基因枪介导法和农杆菌介导法，以转基因技术为基础的基因组编辑技术尤其是CRISPR/Cas9技术正在植物改良中迅速发展。

1　基因枪转化技术与转基因植物的安全性

基因枪法属于一种物理操作，以高压氦气作为驱动力，即将拟转化的基因包裹到直径为1.0μm左右的金粉颗粒表面，均匀涂抹在载体膜片上，按动击发按钮后高压气体冲破压力控制膜片，载体膜高速向下运动，被稍下位置的金属阻挡网阻挡，上面携带的金属微粒脱离后继续高速向下运动，击中样品室中的植物组织靶材料，目标基因随金属微粒进入植物细胞，进一步进入植物细胞核，并整合到植物染色体上（图1），通过筛选和组织培养再生环节获得转基因植株。转入的目标基因随植物细胞的分裂而复制，随植物的开花结实而稳定遗传。利用基因枪转化植物所改良的性状由转入的目标基因决定，基因枪转化技术并不能引起植物基因组的改变和性状的变异。基因枪转化法已经在很多作物上取得了成功，如小麦、玉米、大麦、大豆等，并将一些与抗病性、抗逆性、品质、生长发育等性状改良相关的基因转入了上述植物，但迄今为止只有美国孟山都公司利用基因枪转化获得的抗虫转基因玉米获准商业化生产，利用基因枪转化改良的其他植物品种还没有获准在生产上种植。基因枪转化法虽然有转化受体品种范围宽、可以进行细胞器转化等优点，但同时具有操作比较复杂、成本比较高、转化片段不明确、转入基因容易沉默等缺点，所以，该方法目前主要用于基因功能鉴定、亚细胞定位等基础研究。

图1　基因枪转化植物技术示意图

2　农杆菌转化技术与转基因植物的安全性

农杆菌转化属于一种生物操作，所有农杆菌细胞内除了染色体之外，都含有数量不等的环状Ti质粒或Ri质粒，上面携带一段可以自然转入植物的DNA片段（transfer DNA，T-DNA）。在农杆菌侵染植物组织，使植物产生冠瘿瘤的过程中，T-DNA即进入植物细胞，在一些植物蛋白质的保护和协助下进入植物细胞核，并进一步整合到植物染色体上（图2），通过在含有抗生素的培养基上筛选和组织培养再生环节获得转基因植株。转入基因同样随植物细胞的分裂而复制，随植物的有性繁殖或无性繁殖而稳定遗传。作为革兰氏阴性细菌的成员之一，农杆菌广泛存在于土壤中，可以天然转化双子叶植物，是天然的“遗传工程师”。2015年比利时、中国、美国和国际马铃薯研究中心的科学家们合作在顶级刊物PNAS上发表文章，他们对291个非转基因的栽培甘薯品种进行了DNA分子检测和基因表达分析，在所有的检测样品都发现了农杆菌序列的存在，并发现其中4个基因与农杆菌中的Acs、C-prot、iaaH和iaaM基因同源，这4个基因在甘薯的茎、叶和块根中都有表达。认为在甘薯的进化过程中，农杆菌和甘薯祖先之间发生了水平基因转移，自然选择又保留了这些性状。表明甘薯是一种天然的转基因植物，转基因在甘薯生长发育过程中已经自然发生。而人类种植甘薯的历史可以追逐到8000～10000年前，即人类在不知不觉中食用了几千年的天然转基因甘薯。

图2　农杆菌转化植物技术示意图

农杆菌既然可以天然侵染和转化甘薯，同样可以天然侵染和转化其他双子叶植物，亦即人类食用的其他双子叶植物或许也含有农杆菌天然转入的基因。20世纪90年代以前，人们仅认识到双子叶植物是农杆菌的天然宿主。此后，经过科学家们对农杆菌侵染条件的优化，农杆菌可以侵染并转化水稻、玉米、小麦、大麦等单子叶植物。由于农杆菌转化技术具有操作简单、成本低廉、转基因沉默几率小、插入基因拷贝数低等优点，已经成为培育转基因植物品种的首选技术。截至近几年，利用农杆菌转化成功的植物已达到100多种。事实上，目前全球大面积推广的转基因大豆、玉米、棉花、油菜和木瓜大多都是借助农杆菌转化技术获得的产品。需要再次强调的是，利用农杆菌转化技术转入植物中的仅仅是人为构建到其环状质粒T-DNA区的目标基因，农杆菌染色体上和环状质粒上T-DNA区之外的基因并不进入植物。农杆菌转化技术不会导致植物中非目标基因控制性状的遗传变异，所以，天然的农杆菌转化技术不具有风险性。只要经过严格安全性评价的目标基因对植物、人类、环境、动物和微生物无害，利用农杆菌转化法获得的转基因产品势必具有安全性。

3　 CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其产品的安全性

CRISPR/Cas9技术是根据拟编辑、修饰或激活的目标基因序列，设计一段20bp左右的引导RNA序列（gRNA），将该gRNA序列与核酸酶Cas9编码序列（具有酶切功能，类似一把剪刀）构建到表达载体上，利用农杆菌或基因枪方法转入植物细胞，gRNA引导Cas9对与gRNA具有同源性的目标基因进行编辑，达到优化、沉默或激活目标基因的目的。基因编辑技术可以不涉及到外源DNA序列的整合，尽管在获得的T0代转基因植株中外源gRNA序列、Cas9序列和筛选标记序列有可能插入到植物基因组上，但由于gRNA序列、Cas9序列和筛选标记序列与目标基因不存在连锁关系，在T0代转基因植株自交后产生的T1代转基因植株中，能够非常容易地筛选到目标基因编辑而不含有表达载体上任何序列（包括gRNA、Cas9和筛选标记）的期望植株。因此，基因组编辑只对植物中原本存在的目标基因进行了修饰，沉默植物中的不良基因，激活植物中的优良基因或增强优良基因的表达水平，但基因编辑植株中不含体外转入的DNA序列，基因组编辑植株并非真正意义上的转基因植株，在本质上等同于传统育种方法获得的遗传变异，进一步培育的植物品种安全可靠。因而，一些国家已出台政策，将不对利用基因组编辑技术获得的植物产品进行任何形式的安全性评价。最近，美国农业部宣布免除对CRISPR/ Cas9基因组编辑工具进行遗传修饰的蘑菇进行监管，批准种植和销售，成为第一例得到美国政府上市许可的CRISPR/Cas9基因组编辑生物品种。

2016-06-29）