白细胞介素-23R Arg381Gln基因多态性与炎症性肠病相关性研究*

徐旭张恒斌钟丽梅

白细胞介素-23R Arg381Gln基因多态性与炎症性肠病相关性研究*

徐旭①张恒斌①钟丽梅①

目的：探讨白细胞介素-23R Arg381Gln基因多态性与炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）相关性。方法：采用序列特异性引物配合聚合酶链反应（polymerasechain reaction with sequence specific primers，PCR-SSP）技术对125例炎症性肠病患者（研究组：UC组78例，CD组47例）与120例健康体检者（对照组）IL-23R基因非同义单核苷酸多态性（IL-23R Arg381Gln）进行分析，计算等位基因的表现频率，评估IL-23R Arg381Gln基因多态性与炎症性肠病相关性。结果：UC组、CD组、对照组A等位基因的表现频率分别为5.13%、2.13%、5.83%，三者比较差异无统计学意义（P＞0.05），但CD组A等位基因的表现频率稍低于UC组与对照组。UC组、CD组、对照组G等位基因的表现频率分别为6.41%、6.38%、5.83%，比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：白细胞介素-23R Arg381Gln基因多态性与炎症性肠病无显著的关系，个体遗传差异性可能决定炎症性肠病的易感性。

白细胞介素-23R； Arg381Gln； 基因多态性； 炎症性肠病

炎 症 性 肠 病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）是指机体肠道非特异性炎症反应导致的自身免疫性疾病。本病的疾病类型主要有溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）与克罗恩病（Crohn’s Disease，CD）。文献［1-2］证实，IBD与遗传因素具有紧密的关系。IL-23R Arg381Gln基因多态性可能对IBD发生发展具有重要的作用［3］。本研究通过分析IL-23R Arg381Gln基因多态性与IBD的关系，以探讨IL-23R Arg381Gln对IBD患者发病机制的调控作用，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料 选取2012年1月-2015年1月本院确诊为IBD汉族患者125例作为研究组，男60例，女65例，年龄12～87岁，平均（45.62±15.23）岁，其中溃疡性结肠炎78例作为UC组，克罗恩病47例作为CD组。同期选取健康体检者120例作为对照组，男58例，女62例，年龄11～85岁，平均（45.59±15.17）岁。各组患者在性别、年龄等一般资料方面比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。全部研究对象临床资料完整，自愿参加本研究试验并签署知情同意书。本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2纳入与排除标准 （1）纳入标准：IBD的诊断标准参照中华医学会IBD诊治共识意见［4］。（2）排除标准：合并系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎与哮喘等自身免疫性疾病，合并肝肾功能障碍，心肺功能不全与精神性疾病患者。

1.3方法 （1）制备基因组DNA：全部研究对象收集外周血样本5 mL，置于二乙胺四乙酸二钾（Ethylenediaminetetraacetic Acid-K2，EDTA-K2）抗凝试管内，采用基因组DNA提取试剂盒 （Tiangen BioTech Beijing Co.LTD公司，中国）提取基因组DNA，根据吸光度明确DNA产物纯度与浓度，采用去离子稀释基因组DNA样品至50 ng/μL。（2）IL-23R基因PCR反应：序列特异性引物配合聚合酶链反应（polymerasechain reaction with sequence specific primers，PCR-SSP）技术，参照基因库（GenBank）中IL-23R基 因 序 列（NC_000001.10）， 采 用primer5.0设计引物以包含目标位点（rsl 1209026）：正义：5’-GAGCAGAGTAAAGAGAATAGTAA-3’，反义：5’-TGGGCTGAGGACTTAGCCTCTTTAAGC CTC-3’（中国上海Sangon公司合成），PCR总体系10 μL（水2 μL+PCR主要混合物5 μL+正义反义引物2 μL+模板DNA 1 μL），反应条件：95 ℃预变性1 min；33个循环（95 ℃ 10 s，60 ℃30 s）；72 ℃ 15 s；4 ℃ 30 min，目标基因片段长约461 bp。（3）PCR测序反应：PCR测序引物：5’-GAGCAGAGTAAAGAGAATAGTAA-3’；目的基因片段扩增（rsl 1209026），测序反应条件：96 ℃变性2 min，PCR循环（参数：96 ℃ 10 s；50 ℃ 5 s；60 ℃ 4 min；25个循环），扩增完成后4 ℃保温。醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物，电泳，采集测序图谱（上海纳欣生物有限公司）。（4）计算等位基因频率：采用Chromas软件，根据IL-23R目标基因位点正常碱基排列序列采集目标位点的等位基因，计算等位基因的表现频率。

1.4统计学处理 本研究数据采用SPSS 18.0统计学软件进行分析，计量资料以（）表示，比较采用t检验，计数资料的比较采用 χ2检验，全部等位基因的表现频率的相关数据均符合Hardy-Weinberg平衡定律，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1基因组DNA与IL-23R基因PCR扩增产物 基因组DNA中A260/A280比值为1.7～1.85，0.8%琼脂糖凝胶电泳分析结果见图1；IL-23R基因PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳分析结果见图2。

2.2IL-23R Arg381Gln基因多态性分析 PCR测序反应结果为单峰、纯合基因型，rsl 1209026，C.1142 G＞A，P.Arg381Gln存在单核苷酸多态性G/A，见图3。CD组A等位基因的表现频率稍低于UC组与对照组，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），提示等位基因A可能对CD具有保护作用。UC组与对照组A等位基因的表现频率相近，三组IL-23R Arg381GlnGG等位基因的表现频率比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1　各组IL-23R Arg381Gln基因多态性比较 例（%）

图1　IL-23R 基因组DNA电泳图（0.8%琼脂糖凝胶）

图2　IL-23R 基因PCR扩增产物电泳图（2%琼脂糖凝胶）

图3　IL-23R Arg381G1n等位基因G/A测序图谱

3　讨论

目前，关于炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）的病理原因与病理机制尚未完全明确。但遗传因素在IBD发生与发展中具有重要的作用。文献［5］表明，同卵双生人群UC发生率为5%～20%，CD发生率为40%～60%。同时，文献［6］显示，当一级亲属患有IBD，则IBD发生风险则可能增加15倍。IBD是多基因参与的自身免疫性疾病，IBD易感基因位点已经成为了IBD研究的热门领域之一。白细胞介素-23（Interleukin-23， IL-23）是目前针对自身免疫性疾病的重要细胞因子，IL-23功能的实现有赖于白细胞介素-23受体（Interleukin-23 Receptor，IL-23R）［7］。IL-23R非同义单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism. SNP）RSL 1209026，C.1142 G＞A，P.Arg381Gln基因可能与IBD的发生与发展具有紧密的关系［8-10］。IL-23R定位 于染色体IP32.1-p31.2，编 码 区2.9×103，由11个外显子组成［11］。IL-23R通过与lL-23/IL-23R/Thl7/IL-17途径导致肠黏膜非特异性炎症反应［12］。SNP是人类最为常见的可遗传变异基因，占已知基因多态性的90%以上［13］。通过比较CD与对照人群的全基因组扫描结果发现，IL-23R 1142位点上具有一个改变IL-23R氨基酸编码的基因多态性（1142 G＞A）。1142 G＞A是一个非同义SNP，碱基G由A替代，使IL-23R氨基酸编码的蛋白质中的一个精氨酸转变为谷氮酰胺（RSL 1209026，C.1142 G＞A，P.Arg381Gln），从而导致蛋白质功能异常［14-16］。Arg381Gln基因在IBD患者家族中存在明显不平衡传递现象，从而导致IBD疾病的发生与发展［17］。但国际上关于IL-23R Arg381Gln 与IBD的相关性研究结果差异显著。部分研究肯定了IL-23R Arg381Gln与非犹太人群IBD患儿具有紧密的关系［18］。但部分研究则否认IL-23R Arg381Gln与智利、日本IBD患者的关系［19］。因此，IL-23R Arg381Gln可能存在个体遗传差异性，但关于我国关于IL-23R Arg381Gln基因多态性与炎症性肠病相关性研究较为罕见。

本研究结果显示，我国IL-23R Arg381Gln存在单核苷酸多态性G/A，其中CD患者IL-23R Arg381Gln的A等位基因的表现频率为2.13%，稍低于UC患者（5.13%）与健康体检者（5.83%），因此，IL-23R Arg381Gln的A等位基因可能对CD具有一定程度的保护作用。分析其原因主要为IL-23R Arg381Gln基因多态性（C.1142 G＞A）使IL-23R氨基酸编码的蛋白质中的某一个精氨酸转变为谷氨酰胺，而谷氨酰胺可作为物质代谢的关键营养物质，其对肠道黏膜生长具有重要的免疫调节功能，在维持肠道黏膜屏障功能与结构中具有重要的价值［20-21］。结合本研究结果，UC、CD患者与健康体检者IL-23R Arg381Gln等位基因的表现频率比较差异无统计学意义（P＞0.05），提示IL-23R Arg381Gln基因多态性与IBD无显著的关系。但相关文献证实，IL-23R Arg381Gln具有个体遗传差异性。同时，由于本研究样本量较小，进一步确切的研究结果尚有待进一步的研究探讨。

综上所述，我国IL-23R Arg381Gln基因多态性（l209026，C.1142G＞A，P.Arg381Gln） 与 炎 症性肠病无显著的关系，个体遗传差异性可能决定炎症性肠病的易感性。但由于样本量较小，IL-23R Arg381Gln基因多态性与IBD的确切关系尚有待进一步探讨。

［1］ Steponaitiene R，Kupcinskas J，Survilaite S，et al.TPMT and ITPA genetic variants in Lithuanian inflammatory bowel disease patients：Prevalence and azathioprine-related side effects［J］.Adv Med Sci，2015，61（1）：135-140.

［2］徐亚，陈志荣.我国人群IL-23R基因多态性与IBD的相关性分析［J］.临床消化病杂志，2011，23（5）：267-269.

［3］陆忠凯，陈志荣，朱俊义，等.IL-23R基因多态性与炎症性肠病的相关性［J］.世界华人消化杂志，2011，19（19）：2076-2080.

［4］马夫天.干细胞移植治疗炎症性肠病的研究进展［J］.中华消化杂志，2015，35（10）：715-717.

［5］李媚，高翔，胡品津.IL-23及其受体IL-23R与克罗恩病的关系［J］.世界华人消化杂志，2008，16（4）：392-398.

［6］ Zhang Q，Fan H W，Zhang J Z，et al.NLRP3 rs35829419 polymorphism is associated with increased susceptibility to multiple diseases in humans［J］.Genet Mol Res，2015，14（4）：13 968-13 980.

［7］ Taleban S，Li D，Targan S R，et al.Ocular manifestations in inflammatory bowel disease are associated with other extra-intestinal manifestations，gender，and genes implicated in other immunerelated traits［J］.J Crohns Colitis，2016，10（1）：43-49.

［8］徐忠玉，房光萃.强直性脊柱炎与IL-23R基因多态性关联的Meta分析［J］.现代免疫学，2015，35（6）：477-481.

［9］曹全富，叶锦，付成伟.重庆地区膀胱癌人群IL-23R rs10889677位点单核苷酸多态性与膀胱癌易感性的相关性分析［J］.实用临床医药杂志，2015，19（9）：73-75.

［10］张吉林，刘冲.IL-23R基因多态性与吉林人群强直性脊柱炎易感性的关联研究［J］.中国免疫学杂志，2015，31（2）：230-235.

［11］和慧，刘长欢.IL-23R基因多态性与口腔扁平苔癣的相关研究［J］.中国实验诊断学，2015，19（5）：722-724.

［12］顾雪疆，沈飞霞，朱虹，等.IL-23受体基因多态性和Graves病的相关性研究［J］.温州医学院学报，2010，40（5）：456-458.

［13］覃彦平，曹昭，覃锦耀，等.IL-23R基因单核苷酸多态性与肝癌预后的关系［J］.右江民族医学院学报，2015，37（1）：20-22.

［14］张吉林，刘冲，单雪梅，等.强直性脊柱炎患者中IL-23 R基因rs7517847多态性分析［J］.北华大学学报：自然科学版，2014，15（6）：735-738.

［15］覃彦 平， 秦雪，曹昭，等.IL-23R基因rs17375018、rs11805303位点单核甘酸多态性分析［J］.生物技术，2014，24（1）：54-58.

［16］李志华，王宇飞，韩捷.IL-23R基因多态性与桥本甲状腺炎关联性研究［J］.济宁医学院学报，2014，37（4）：256-259.

［17］ Lin X，Jin L，Pan C，et al.Associations of Crohn’s disease with DR4 and DR5 gene polymorphisms［J］.Chinese Journal of Medical Genetics，2015，32（5）：715-722.

［18］ Bank S，Andersen P S，Burisch J，et al.Polymorphisms in the toll-like receptor and the IL-23/IL-17 pathways were associated with susceptibility to inflammatory bowel disease in a danish cohort［J］.PLoS One，2015，10（12）：145-152.

［19］ Guo M，Min X，Xia X，et al.Association of inflammatory bowel disease with the polymorphisms and haplotypes of fucosyltransferase 3 gene［J］.Chinese Journal of Medical Genetics，2015，32（6）：849-854.

［20］宋军民，杨超，常远，等.炎症性肠病患者肠道菌群变化与发病关系研究［J］.中华医院感染学杂志，2015，25（15）：3425-3427.

［21］ Volodko N，Salla M，Eksteen B，et al.TP53 codon 72 Arg/Arg polymorphism is associated with a higher risk for inflammatory bowel disease development［J］.World J Gastroenterol，2015，21 （36）：10 358-10 366.

The Correlation Study between Interleukin-23R Arg381Gln Gene Polymorphism and Inflammatory Bowel Disease/

XU Xu，ZHANG Heng-bin，ZHONG Li-mei.//Medical Innovation of China，2016，13（26）：009-012

Objective：To study the correlation between interleukin-23R Arg381Gln gene polymorphism and inflammatory bowel disease.Method：By sequence specific primers and PCR technique in 125 cases of inflammatory bowel disease（study team：UC group of 78 cases，CD group of 47 cases）and 120 healthy checkup （control group）IL-23R genes non-synonymous single-nucleotide polymorphisms were analyzed and the allele performance frequency were calculated.The correlation between IL-23R Arg381Gln gene polymorphism and inflammatory bowel disease was evaluated.Result：The allele performance frequency of UC group，CD group and control group were 5.13%，2.13%，5.83%，the comparison difference among groups had no statistical significance （P＞0.05），but A allele performance frequency of CD group was slightly lower than UC group and control group.The G allele performance frequency of UC group，CD group and control group were 6.41%，6.38%，5.83%，compared among groups with no significant difference（P＞0.05）.Conclusion：It has no significant correlation between IL-23R Arg381Gln gene polymorphism and inflammatory bowel disease，the individual genetic differences may determine the susceptibility of inflammatory bowel disease.

Interleukin-23R； Arg381Gln； Genetic polymorphism； Inflammatory bowel disease

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.26.003

2016-01-19） （本文编辑：蔡元元）

深圳市宝安区科技计划项目（2013242）

①广东省深圳市宝安区中心医院 广东 深圳 518102

徐旭

First-author’s address：Shenzhen Baoan District Central Hospital，Shenzhen 518102，China