HPLC法测定盐酸普拉克索平衡溶解度和表观油水分配系数

杨 滨，马攀勤，孙 进*，夏 欣，仵明瑞



HPLC法测定盐酸普拉克索平衡溶解度和表观油水分配系数

杨 滨1，马攀勤2，孙 进1*，夏 欣1，仵明瑞1

(1. 沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳110016; 2. 宁夏康亚药业有限公司，宁夏银川 750000)

目的测定盐酸普拉克索在不同介质中的平衡溶解度及其在正辛醇-水/缓冲溶液体系中的表观油水分配系数，为设计盐酸普拉克索新剂型提供依据。方法采用摇瓶-高效液相色谱法测定盐酸普拉克索在水中和不同pH值缓冲液中的平衡溶解度及表观油水分配系数。结果37 ℃时盐酸普拉克索在水中的平衡溶解度为570 g·LPPP-1PPP，平衡溶解度随pH值的增大而变小，表观油水分配系数随pH值的增大而增大。结论 37 ℃时盐酸普拉克索易溶于水，pH值影响平衡溶解度和油水分配系数，但变化趋势都较小。

药剂学；平衡溶解度；表观油水分配系数；高效液相色谱法；盐酸普拉克索

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是中老年人常见的一种慢性进行性中枢神经系统退行性疾病，常见的临床症状为静止性震颤、进行性运动迟缓，严重者伴有记忆障碍等痴呆症状PPP[1]PPP。PD的主要病理学特征是多巴胺能神经元缺失及残存神经元胞质内路易小体（Lewy 小体）的出现PPP[2]PPP。盐酸普拉克索的化学名为（-）-2-氨基-6-丙基胺-4,5,6,7-四氢苯并噻唑二盐酸盐，分子式为CBBB10BBBHBBB19BBBCBBBl2BBBNBBB3BBBS，相对分子质量为284.25，化学结构式见图1。

Fig. 1 Chemical structure of pramipexole dihydrochloride

盐酸普拉克索片（pramipexole dihydrochloride immediate release tablets，Mirapex IR）首先由德国勃林格殷格翰(Boehringer-Ingehelm)公司开发，1997年5月在美国上市，大量的临床试验证明，盐酸普拉克索对于PD的治疗具有安全、有效、毒性低并且不良反应小等优点PPP[3-5]PPP。药物的平衡溶解度和表观油水分配系数与其在生物体内的膜渗透性具有很大相关性，有助于预测药物在体内的动力学性质。目前，在国内外的文献中，均未见对盐酸普拉克索平衡溶解度和表观油水分配系数的报道。本文作者参考相关文献，采用摇瓶-HPLC法测定盐酸普拉克索在水和不同介质中的平衡溶解度和表观油水分配系数，为预测盐酸普拉克索的动力学性质及设计盐酸普拉克索新剂型提供依据。

1 仪器与材料

HITACH高效液相色谱仪包括四元泵和DAD检测器（日本日立公司），HZQ-C水浴振荡机(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)，EU-pH700 pH 计(美国 Eutech 公司)，KQ-100超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)，TGL-16台式冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司)，LDZ5-2低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)，AR1140电子分析天平(美国Ohaus公司)，BT25十万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司)。

盐酸普拉克索对照品(质量分数为99.8%，US，批号1553859)，盐酸普拉克索原料药（纯度质量分数>99.8%，实验室自制），氨水、磷酸、碳酸（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司），乙腈(色谱纯，天津康科德科技有限公司)，其余试剂（分析纯，市售），水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 0.1 mol·LPPP-1PPP的盐酸溶液的配制

按《中华人民共和国药典》2010年版附录的方法配制，用pH计测定其pH值为1.2。

2.1.2 磷酸盐缓冲液的配制

按《中华人民共和国药典》2010年版附录的方法配制不同pH值的系列磷酸盐缓冲液，测定pH值分别为3.0、5.0、6.50、7.01和7.45。

2.1.3 盐酸普拉克索储备液的配制

称取盐酸普拉克索对照品5 mg，置于100 mL量瓶中，用pH值为3.0的磷酸缓冲液定容，得质量浓度为50 mg·LPPP-1PPP盐酸普拉克索溶液作为储备液。

2.2 测定方法学研究

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ODS柱( 150 mm × 4. 6 mm，5 μm)；流动相：碳酸铵缓冲液（用氨水调pH值为9.5）-乙腈（体积比为80∶20）；流速：1.0 mL·minPPP-1PPP；检测波长：262 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2.2 专属性实验

按“2.1.3”条方法制备盐酸普拉克索对照溶液，将流动相和盐酸普拉克索对照溶液分别注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”条色谱条件测定，记录色谱图，结果见图2。结果表明，主药峰和溶剂峰可以完全分开，在上述的色谱条件下溶剂不影响主药的测定，说明测试方法的专属性较强。

2.2.3 标准曲线的制备

精密量取盐酸普拉克索储备液适量，用pH值为3.0的磷酸缓冲液稀释，分别配制成质量浓度为1、2.5、4、5、6、7.5和10 mg·LPPP-1PPP的系列标准溶液，吸取标准溶液20 μL进样，并记录色谱图。以盐酸普拉克索质量浓度(，mg·LPPP-1PPP) 为横坐标，峰面积（）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为=1.251 5×10PPP4PPP-1.630 4×10PPP3PPP，=0.999 9。结果表明，盐酸普拉克索质量浓度在1~10 mg·LPPP-1PPP内与峰面积线性关系良好。

2.2.4 准确度试验

量取盐酸普拉克索储备液适量，按“2.2.2”条方法配制高（6 mg·LPPP-1PPP）、中（5 mg·LPPP-1PPP）和低（4 mg·LPPP-1PPP）3种质量浓度的对照溶液，按“2.2.1”条色谱条件进行测定，每个质量浓度测定6次，记录峰面积。依据标准曲线得到对应的质量浓度，按公式：准确度=测定质量浓度值/真实质量浓度值× 100%，求出高、中、低质量浓度的准确度。结果高、中、低3种质量浓度的回收率分别为98.44%、99.13%和99.57%，表明该方法的准确度良好。

2.2.5 精密度试验

量取盐酸普拉克索储备液适量，按“2.2.2”条方法配制高（6 mg·LPPP-1PPP）、中（5 mg·LPPP-1PPP）和低（4 mg·LPPP-1PPP）3种质量浓度的对照溶液，按“2.2.1”条色谱条件进行测定，每个质量浓度测定6次，记录峰面积，计算日内 RSD，连续测定 3 d，计算日间 RSD。结果高、中和低3种质量浓度对照溶液的日内 RSD 分别为0. 68%、0. 72%和0. 65%，日间 RSD 分别为1.72%、1.83%和1.12%，表明方法的精密度良好。

2.3 平衡溶解度的测定

将过量的盐酸普拉克索置于5 mL Ep管中，分别加入pH值为5.74的水、pH值为1.2的盐酸水溶液以及pH值分别为3.0、5.0、6.50、7.01、7.45的磷酸盐缓冲液，超声溶解直至溶液过饱和，放入37 ℃水浴恒温摇床振摇72 h，1.2×10PPP4PPPr·minPPP-1PPP离心10 min。取上清液用pH值为3.0的磷酸缓冲液适当稀释后，取20 μL注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”条色谱条件测定，记录峰面积。按外标法计算盐酸普拉克索在各种溶液中的平衡溶解度。结果表明，37 ℃时盐酸普拉克索在水中的平衡溶解度为570 mg·LPPP-1PPP，在各种溶液中的平衡溶解度随溶液pH值的变化不大，结果见表1。

Table 1 Equilibrium solubility of pramipexole dihydrochloride in buffer solutions with various pH at 37 ℃ (± s, n=3)

表1 37 ℃时盐酸普拉克索在不同pH值缓冲溶液中平衡溶解度(± s, n=3)

Table 1 Equilibrium solubility of pramipexole dihydrochloride in buffer solutions with various pH at 37 ℃ (± s, n=3)

Buffer solutionpHρBBBequilibrium solubilityBBB/( g·LPPP-1PPP)Buffer solutionpHρBBBequilibrium solubilityBBB/( g·LPPP-1PPP) 0.1 mol·LPPP-1PPP Hydrochloric acid1.2579.4 ± 4.0Phosphate buffer6.5562.4 ± 3.9 Phosphate buffer3.0576.0 ± 4.3Phosphate buffer 7.01553.5 ± 3.3 Phosphate buffer5.0577.0 ± 4.3Phosphate buffer 7.45550.8 ± 3.7 Water 5.74569.6 ±5.0

2.4 表观油水分配系数的测定

2.4.1 涡旋时间考察

取质量浓度为500 mg·LPPP-1PPP的盐酸普拉克索溶液（被正辛醇饱和的pH值为7.01的磷酸盐缓冲液溶解）1 mL，加入正辛醇溶液（被pH值7.0的磷酸盐缓冲液饱和）7 mL，分别涡旋5、20、45和60 min，3 000 r·minPPP-1PPP离心10 min。弃去正辛醇层，取下层水相，用pH值3.0的磷酸盐缓冲液稀释至线性范围内，取20 µL注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”条色谱条件测定，记录峰面积。按外标法计算盐酸普拉克索的质量浓度，乘以稀释倍数，计算正辛醇层中水相质量浓度(BBBwBBB)，即BBBoBBB=(-BBBwBBB)×1/7。式中：为初始加入的盐酸普拉克索溶液质量浓度，BBBoBBB为油相中药物的质量浓度。结果见表2。

Table 2 Effect of vortex time on the balanced distribution

由表2可以看出，涡旋20 min以上，水相质量浓度几乎不再减少，即认为已达到分配平衡，因此，选择涡旋时间为20 min。

2.4.2 不同 pH值下盐酸普拉克索lg的测定

称取一定量盐酸普拉克索原料药，置于10 mL量瓶中，分别用水（pH值为5.74）、pH值为1.2 的盐酸水溶液以及pH值分别为3.0、5.0、6.50、7.01和7.45的磷酸盐缓冲液（均已被正辛醇饱和）定容，配制不同pH值下的供试溶液。带入标准曲线，求出各供试溶液的质量浓度（）。

分别取上述供试溶液各1 mL作为水相，分别加入已被对应溶液饱和的正辛醇溶液7 mL作为油相，涡旋20 min，3 000 r·minPPP-1PPP离心10 min，弃去上层油相，取一定量水相，用pH值为3.0的磷酸盐缓冲液定容。取20 µL注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”条色谱条件测定，记录峰面积，按外标法计算盐酸普拉克索的质量浓度，乘以稀释倍数，计算水相质量浓度(BBBwBBB)。

药物表观油水分配系数(BBBappBBB)的数学表达式PPP[6-7]PPP为BBBappBBB=BBBoBBB/BBBwBBB。其中，BBBoBBB为平衡后油相中药物的质量浓度，BBBwBBB为平衡后水相中药物的质量浓度。本实验中，水相与油相的体积比为1∶7，故在药物分配达到平衡时BBBoBBB=（–BBBwBBB）×1/7。37 ℃时盐酸普拉克索在不同pH值的缓冲液中的表观油水分配系数见表3和图3。

Table 3 Apparent oil/water partition coefficient of pramipexole dihydrochloride in n-octanol/buffer solution with various pH at 37 ℃(n=3)

Fig. 3 Apparent Oil/Water partition coefficient of pramipexole dihydrochloride in n-octanol-buffer with various pH

结果表明，盐酸普拉克索的表观油水分配系数随着pH值的升高而增大。

3 讨论

3.1 实验方法的选择

常用的测定表观油水分配系数的方法有摇瓶法、液相色谱法、薄层色谱法和产生柱法等PPP[8]PPP。产生柱法过程复杂，所需时间长，色谱法需要用一系列已知lg的同系物来建立标准曲线，价格昂贵，故作者采用简单经典的摇瓶法来测定盐酸普拉克素的表观油水分配系数，同时借助HPLC法对盐酸普拉克索的含量进行测定。该方法在准确度、精密度方面均符合方法学验证的要求，说明该方法准确、可行。

3.2 盐酸普拉克索的肠吸收预测

油水分配系数是指当药物在水相和油相达平衡时，药物在油相中的量与在水相中的量之比。油水分配系数会影响药物在体内的溶解、吸收、分布和转运。由于正辛醇理化性质接近于生物膜, 目前文献也多以正辛醇PPP[9-10]PPP作为有机相，因此作者采用正辛醇-水作为模拟系统。由于体内胃肠道pH值在1.0 ~ 8.0内，因此作者设计了pH值为1.2、3.0、5.0、5.74、6.50、7.01和7.45的介质来模拟体内环境。由于盐酸普拉克索在水相中的溶解度较大，用摇瓶法测定时，大部分的药物都溶解在水相中，因此将水相和油相的体积比增大到1∶7，以利于水相中的药物能够更多的分配到油相中。

4 结论

作者成功的建立了摇瓶-HPLC法测定盐酸普拉克索在不同介质中的平衡溶解度和表观油水分配系数。37 ℃时盐酸普拉克索易溶于水，且溶解度随pH值的增大有变小趋势，但变化不大，表观油水分配系数随pH值增大而增大。本实验为盐酸普拉克索的处方前研究提供了必要的基础，为设计盐酸普拉克索新剂型提供了必要的依据。

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(本篇责任编辑：赵桂芝)

Determination of equilibrium solubility and apparent oil/water partition coefficient of pramipexole dihydrochloride by HPLC

YANG Bin1, MA Panqin2, SUN Jin1*, XIA Xin1, WU Mingrui1

(1,,110016,; 2.,,750000,)

Objective To determine the equilibrium solubility of pramipexole dihydrochloride in various medium and its apparent oil/water partition coefficient partition coefficient in the-octanol-water/buffer solution systems, which will provid a basis for design new formulations. MethodA shake flask- high performance liquid chromatography (HPLC) method was established to determine the equilibrium solubility and apparent oil/water partition coefficientof pramipexole dihydrochloride in water and different pH buffer solutions. Result The equilibrium solubility of pramipexole dihydrochloride was 570 mg·LPPP-1PPPin water at 37 ℃ and the pH of the buffer solution had no influence on its equilibrium solubility. With the increase of solution pH, apparent oil/water partition coefficient of pramipexole dihydrochloride was also rising. ConclusionThe method established in this paper can successfully used todetermine the equilibrium solubility and the apparent oil/water partition coefficient of pramipexole dihydrochloride.

pharmaceutics；equilibrium solubility；apparent oil/water partition coefficient；HPLC； pramipexole dihydrochloride

（2016）01–0026–07

10.14146/j.cnki.cjp.2016.01.004

R94

A

2015-04-13

杨滨 (1988-), 男(汉族), 山东滨州人, 硕士研究生, E-mail yangbin119@126.com;

孙进 (1975-), 男(汉族), 安徽金寨人, 教授, 博士, 博士生导师, 主要从事药物新剂型与新技术研究, Tel. 024-23986325, E-mail sunjin0529@aliyun.com。