香鱼精氨酸酶II基因的cDNA克隆及其表达与鳗弧菌感染的相关性

丁斐斐 李长红 陈炯 张琪

（宁波大学海洋学院 生物化学与分子生物学实验室，宁波 315211）

香鱼精氨酸酶II基因的cDNA克隆及其表达与鳗弧菌感染的相关性

丁斐斐 李长红 陈炯 张琪

（宁波大学海洋学院 生物化学与分子生物学实验室，宁波 315211）

精氨酸酶II（arginase II，Arg-II）是精氨酸酶的一种，不仅可以参与机体尿素循环，还与机体病理过程密切相关。通过香鱼（Plecoglossus altivelis）单核/巨噬细胞转录组测序获得香鱼Arg-II基因全长cDNA序列，结果表明，Arg-II基因由4 707个核苷酸组成，包含一个大的开放阅读框，编码348个氨基酸，预测分子量为38.09 kD，等电点为6.15。氨基酸序列多重比对结果显示，香鱼Arg-Ⅱ具有典型的Arg-Ⅱ结构特征，与虹鳟（Oncorhynchus mykiss）Arg-Ⅱ同源性最高，为85.3%；系统进化树分析表明，鱼类Arg-Ⅱ形成一个大簇，香鱼Arg-Ⅱ与虹鳟Arg-Ⅱ进行相关性最高。实时荧光定量PCR（quantitive real-time PCR，qRTPCR）结果显示，香鱼Arg-Ⅱ基因mRNA主要在健康香鱼肝、脑、头肾和单核/巨噬细胞中表达；鳗弧菌（Vibrio anguillarum）感染后，香鱼肝、脑、头肾和单核/巨噬细胞Arg-Ⅱ基因mRNA的表达量显著上调。综上，香鱼Arg-Ⅱ基因的表达与鳗弧菌感染紧密相关，揭示其可能在鱼类抗感染免疫应答中发挥重要作用。

香鱼；精氨酸酶II；鳗弧菌；单核/巨噬细胞；表达

精氨酸酶（arginase）是在细菌、酵母、植物、无脊椎动物和脊椎动物中普遍存在的酶。在植物和排氨动物中精氨酸酶位于线粒体，而在排尿素动物中，精氨酸酶位于细胞质。细胞质和线粒体中的精氨酸酶是同功酶，由不同的基因精氨酸酶I（arginase I，Arg-I）和精氨酸酶II（arginase II，Arg-II）编码［1］。Arg-I和Arg-II的基本功能是在机体尿素循环中将L-精氨酸水解成L-鸟氨酸和尿素，但二者在免疫系统中也有表达，并且在哺乳动物免疫系统中起着关键作用，参与炎症反应的各个阶段［2］。在巨噬细胞中，Arg-I和诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）参与L-精氨酸/NO代谢，分别与M1和M2型巨噬细胞表型有关，被广泛用作鉴定M1和M2型巨噬细胞的分子标记［3］。与Arg-I相比，Arg-II在巨噬细胞炎症应答中的功能相关的研究报道很少，普遍认为它具有与Arg-II相同的功能。然而，越来越多的证据表明，Arg-I和Arg-II在巨噬细胞功能调节中具有不同的作用。例如，在小鼠中，LPS可诱导巨噬细胞Arg-II mRNA的表达，但不能诱导Arg-I mRNA的表达［1］。

目前，Arg-I和Arg-II基因在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）［4，5］和鲤鱼（Cyprinus carpio）［6］等少数硬骨鱼类中被克隆和鉴定。在虹鳟中，虹鳟幼鱼绝食6周后，肝组织精氨酸酶活性明显增加，并且Arg-II基因mRNA的表达量也明显增加，但Arg-I基因mRNA的表达量无明显变化，因此，肝组织Arg-II基因mRNA的表达量增加可能导致精氨酸酶活性增加［4］；而且两个虹鳟品系感染脑粘体虫（Myxobolus cerebralis）后，T和H品系分别在感染后2 h 和8 d时Arg-II基因mRNA的表达量均显著上调［5］；在鲤鱼中，环腺苷酸（cyclic adenosine mono phosphate，cAMP）刺激后头肾来源巨噬细胞中的精氨酸酶活性显著增加，而且cAMP刺激能诱导Arg-II基因mRNA的表达，但Arg-I基因mRNA的表达也不受影响［6］，揭示鱼类Arg-II可能具有与哺乳动物Arg-II相似的功能。

香鱼（Plecoglossus altivelis）是东亚地区中国、日本和朝鲜等国特有的一种小型名贵经济鱼类。它体色美、味清香、肉质细腻，在国际上被誉为“淡水鱼之王”，深受消费者青睐。近年来，由于捕捞强度增大、水利设施建设以及环境污染日益严重等原因，野生香鱼已濒临灭绝。为了满足国内外市场尤其是国际市场对香鱼的需求，香鱼人工养殖在中国大陆也迅速兴起。目前，香鱼的人工养殖在沿海各省均有开展，主要集中于浙江、福建、江苏、山东、辽宁等地，养殖的香鱼大部分出口日本和欧美等发达国家，效益十分可观。然而，随着养殖规模的不断扩大，由传染性疾病引起的养殖香鱼大量死亡事件时有发生，给中国沿海地区的香鱼养殖业造成巨大损失［7］。因此，有必要从鱼类自身免疫调控入手，对其抗细菌感染的分子机制进行深入研究。本研究通过香鱼单核/巨噬细胞转录组测序，获得香鱼Arg-II基因的cDNA序列，对序列进行比对及进化关系分析，并明确其mRNA的组织表达特征，随后检测鳗弧菌感染后香鱼重要组织及单核/巨噬细胞中Arg-II基因mRNA的表达变化。

1 材料与方法

1.1 材料

健康香鱼（20-25 g）购自宁波水产大世界，规格均一、无病无伤。充气运回实验室暂养，暂养水温（20±1）℃，期间不间断充气，早晚各换水一次，不投喂饵料。

鳗弧菌分离株ayu-H080701分离自患弧菌病香鱼［7］，由本实验室保存。RNAiso试剂、AMV逆转录酶、dNTPs、SYBR Premix Ex Taq 试剂盒和Ex Taq DNA 聚合酶均购自 TaKaRa 公司（日本）。Ficoll购自Invitrogen公司（上海），RPMI1640培养基、胎牛血清（FCS）购自Gibco公司（美国）。引物合成及序列测定由英维捷基贸易有限公司合成（上海）。

1.2 方法

1.2.1 香鱼Arg-II基因cDNA序列的获得及序列分析 采用Illumina HiSeq 2000测序平台对香鱼头肾来源的单核/巨噬细胞进行转录组测序，从测序结果中筛选Arg-II相关Unigenes，通过特异性引物PCR扩增cDNA和测序验证序列准确性。同源蛋白序列比对采用BLASTP 软件（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/）；信号肽序列预测采用SignalP 4.1软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）；蛋白分子量大小及等电点测定采用Compute pI/Mw程序（http：//web.expasy.org/compute_pi/），多重序列比对采用ClustalW软件（http：//clustalw.ddbj.nig.ac.jp/）；系统进化树构建采用MEGA 5.0软件［8］；线粒体靶向肽预测采用MitoProt软件（http：//ihg.gsf.de/ihg/mitoprot. html）。氨基酸序列多重比对及进化树构建所用序列信息详见表1。

表1 氨基酸序列多重比对及进化树构建所用序列

1.2.2 样品采集

1.2.2.1 组织样品采集 香鱼暂养1周后，随机选取5尾，分别取肝、脾、肾、头肾、脑、心、鳃、肌肉和肠组织立即投入液氮保存，随后转于-70℃超低温冰箱保存，收集的组织作为健康香鱼样品。其余香鱼分为对照组和注射组用于鳗弧菌感染实验，鳗弧菌感染香鱼的实验过程及感染剂量参考杨旦阳等［9］的方法，具体步骤如下。注射组香鱼以1.0×104CFU/尾的浓度腹腔注射鳗弧菌菌悬液，对照组香鱼注射等体积的无菌生理盐水，于感染后4、8、12和24 h取肝、脾、肾、头肾、脑和肠等组织，立即投入液氮中，随后转于-70℃超低温冰箱保存。

1.2.2.2 香鱼头肾来源的单核/巨噬细胞分离培养 将香鱼麻醉，用无菌注射器从尾静脉取血，然后快速取出头肾，用无菌剪刀将头肾剪碎置尼龙网内，加入适量含2% FCS的RPMI1640培养基，用10 mL注射器活塞头轻柔研磨头肾组织，使头肾细胞通过尼龙网进入离心管中；采用Ficoll密度梯度离心法离心，弃上清，用含2% FCS的RPMI1640培养基洗涤细胞，最后将细胞重悬于含2% FCS的RPMI1640培养基中。将细胞悬液铺于直径为35 mm的细胞培养皿中，24℃过夜培养，PBS洗去非黏附细胞，然后向培养基中加入10% FCS的RPMI1640培养基。用姬姆萨染色后显微镜下观察，确定95%的黏附细胞是单核/巨噬细胞。

1.2.2.3 鳗弧菌感染香鱼单核/巨噬细胞 用PBS将鳗弧菌稀释至合适浓度，按照感染复数（multiplicity of infection，MOI）为20∶1的比例接种至香鱼单核/巨噬细胞中，对照组加入等体积的PBS，于感染后4、8、12和24 h时小心吸走培养基，PBS洗涤3次后加入1 mL RNAiso试剂，室温孵育5 min以裂解细胞，收集裂解液作为香鱼单核/巨噬细胞样品，保存于-70℃超低温冰箱备用。

1.2.2.4 香鱼Arg-II基因 mRNA的组织表达特征采用qRT-PCR测定健康香鱼不同组织中Arg-II基因 mRNA的表达特征。参考黄左安等［10］的方法进行总RNA抽提、第一链cDNA合成和qRT-PCR分析。根据香鱼ArgⅡ基因全长cDNA序列设计qRTPCR的检测引物，预期扩增片段为158 bp（表2）。以香鱼β-actin基因作为内参，预期的扩增片段长度为231 bp。以香鱼各组织第一链cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，25 μL的扩增体系包括：ddH2O 10 μL、SYBR Premix Ex Taq（2×）缓冲液12.5 μL、正向和反向引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA模板0.5 μL。扩增反应在北京博奥生物芯片有限公司生产的晶芯RT-Cycler实时荧光定量PCR 仪上进行，反应条件为：94℃ 180 s（预变性，1个循环）；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s（扩增段，共40个循环）；94℃ 30 s，72℃ 60 s，95℃ 30 s（熔解段，1个循环）。qRT-PCR检测时每个样品重复3次，包括目的基因（Arg-II）和内参基因（β-actin）。利用相对标准曲线法2-ΔΔCt对定量结果进行计算，分析Arg-II基因mRNA的相对表达量［11］。

1.2.3 感染鳗弧菌对香鱼重要组织和单核/巨噬细胞Arg-II基因mRNA表达的影响 以鳗弧菌感染香鱼的肝、脾、肾、头肾、脑和肠等组织以及鳗弧菌体外感染的香鱼单核/巨噬细胞cDNA为模板，采用qRT-PCR技术检测Arg-II基因mRNA的表达变化。总RNA抽提、第一链cDNA合成和qRT-PCR分析见1.2.3。

表2 qRT-PCR所用引物

2 结果

2.1 香鱼Arg-II基因cDNA序列分析

转录组测序和特异引物PCR扩增测序揭示，香鱼Arg-II基因cDNA序列长4 707个核苷酸（Gen-Bank登录号：KR018612），包含一个1 047 bp的大开放阅读框架，推测编码一个由348个氨基酸组成、相对分子质量为38.09 kD的蛋白，等电点为6.15，N-末端无信号肽序列。氨基酸序列多重比对结果（图1）显示，香鱼Arg-II具有典型的Arg-II结构特征，N-末端含由41个氨基酸组成的线粒体靶向肽，分子内含4段精氨酸家族的特征性序列。

序列分析表明，香鱼Arg-II与其它鱼类Arg-II氨基酸序列同一性为81.6%-85.3%，其中与虹鳟Arg-II氨基酸序列同一性最高，达85.3%；与哺乳动物、鸟类及两栖动物Arg-II的氨基酸序列同一性仅为51.2%-63.3%。系统进化树（图2）分析揭示，哺乳动物、鸟类、两栖类和鱼类的Arg-II分别成簇，香鱼Arg-II位于鱼类Arg-II这一个大簇，且与虹鳟Arg-II进化关系最近。

2.2 健康香鱼Arg-II基因mRNA的组织表达特征

取健康香鱼心、肝、脾、体肾、头肾、鳃、脑、肠和肌肉等进行qRT-PCR检测，香鱼Arg-II基因扩增产物为158 bp，内参β-actin基因扩增产物为231 bp。结果（图3）表明，健康香鱼Arg-II基因mRNA主要在肝、脑和单核/巨噬细胞中表达，其次是头肾、肠、体肾和脾，其他组织中微弱表达。

2.3 香鱼Arg-II基因mRNA的表达与鳗弧菌感染的相关性

根据Arg-II基因在健康香鱼组织中的表达特征，选取鳗弧菌感染的香鱼肝、脑和头肾组织，以及鳗弧菌感染的体外培养的头肾来源单核/巨噬细胞，进行qRT-PCR分析。结果（图4）表明，香鱼肝组织中Arg-II基因mRNA表达量在感染4 h时开始增加，8 h时显著高于对照组，为对照组的5.2倍，12 h时略有降低，24 h时回复至对照组水平；头肾组织中Arg-II基因mRNA表达量在感染8 h和12 h时显著高于对照组，分别为对照组的1.97倍和2.38倍；脑组织中Arg-II基因mRNA的表达量在感染4 h时开始增加，12 h时显著高于对照组，为对照组的1.79倍，随后降低，24 h时与对照组无明显差异；香鱼头肾来源单核/巨噬细胞在鳗弧菌感染后，Arg-II基因mRNA的表达量逐渐增加，12 h时表达量最高，为对照组的3.1倍，24 h略有降低，但仍显著高于对照组，为对照组的2.6倍。

3 讨论

本研究通过香鱼单核/巨噬细胞转录组测序获得了Arg-II基因的全长cDNA序列。序列分析表明，预测的香鱼Arg-II蛋白氨基酸序列与其他物种Arg-II的结构相似，N-末端包含一个线粒体靶向肽。Arg-II是线粒体蛋白，需要通过N-末端线粒体靶向肽进入线粒体基质。MitoProt软件分析表明，硬骨鱼类、两栖类与哺乳动物Arg-II N-末端线粒体靶向肽的长度和序列上差异明显，但有两个共同特征，精氨酸、丙氨酸和丝氨酸等阳离子氨基酸残基含量丰富，天冬氨酸和谷氨酸等阴离子氨基酸残基含量稀少［4］。系统进化树分析表明，鱼类Arg-II独立成簇，香鱼与虹鳟Arg-II进化相关性最高。组织差异特征分析表明，Arg-II基因在健康香鱼各组织中分布广泛，其中肝、脑和单核/巨噬细胞表达量最高，这与虹鳟、鲤鱼中的研究结果较为一致［4，6］。

图1 香鱼与其他物种Arg-II全长氨基酸序列多重比对结果

图2 基于Neighbor-Joining法构建香鱼和其他物种全长Arg-II氨基酸序列的系统进化树

图3 健康香鱼Arg-II基因mRNA的组织表达特征

在哺乳动物中，Arg-II不仅参与机体尿素循环，还与机体病理过程密切相关。早期的研究表明，Arg-II基因是抑制巨噬细胞炎症因子表达的肝X（liver X receptor）受体的直接靶标，因此，它最初被认为具有抗炎功能［12，13］。与哺乳动物相比，硬骨鱼类Arg-II的研究报道相对较少，已有的研究揭示，Arg-II可能与鱼类免疫反应密切相关。例如，在虹鳟中，虹脑粘体虫感染后，品系T和H在感染后2 h和8 d时Arg-II基因mRNA表达量均显著增加，分别增加了4倍和2.7倍［5］；在鲤鱼中，cAMP处理后，头肾来源巨噬细胞精氨酸酶活性显著增加，Arg-II基因表达量在6 h达到最大，约为对照组的16倍［6］。本研究中，鳗弧菌腹腔注射香鱼后，Arg-II mRNA表达在头肾和单核/巨噬细胞中显著上调，这与上述研究结果较为一致。同时，香鱼肝和脑中Arg-II基因表达量也在鳗弧菌感染后显著上调，揭示Arg-II与鱼类病原感染引起的免疫应答密切相关，可能通过激活巨噬细胞旁路激活途径参与免疫反应，但具体作用机制有待于进一步研究。

4 结论

香鱼Arg-II基因cDNA序列与虹鳟Arg-II序列最相似。健康香鱼中，Arg-II mRNA主要在肝、脑和单核/巨噬细胞中表达；鳗弧菌感染后，Arg-II mRNA表达量显著上调，揭示Arg-II与香鱼抗病原感染的免疫反应紧密相关。

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图4 鳗弧菌感染对香鱼重要组织及单核/巨噬细胞Arg-II基因mRNA表达的影响

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（责任编辑 李楠）

cDNA Cloning of Arginase II Gene in Ayu（Plecoglossus altivelis）and the Correlation Between Its Expression and Vibrio anguillarum Infection

DING Fei-fei LI Chang-hong CHEN Jiong ZHANG Qi
（Biochemistry and Molecular Biology Laboratory，School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211）

Arginase II（Arg-II）is one kind of arginases. Not only can it participates in the urea cycle， but also has close correlation with pathological process. Here， we determined the whole cDNA sequence of Arg-II gene of ayu（Plecoglossus altivelis）by de-novo transcriptome sequencing of ayu monocytes/macrophages. The results showed that the cDNA sequence of the Arg-II was 4707 nucleotides， containing a large open reading frame that encoded a protein of 348 amino acids with a deduced molecular mass of 38.09 kD and a theoretical isoelectric point（pI）of 6.15. Multiple sequence alignment of complete amino acid sequences showed that ayu Arg-II had the typical characters of Arg-II in animals. Sequence comparison showed that ayu Arg-II shared the highest amino acid sequence identity（85.3%）with that of rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）. Phylogenetic tree analysis also confirmed that fish Arg-II formed a cluster， and ayu Arg-II was most closely related to that of rainbow trout. Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）analysis showed that the mRNA of ayu Arg-II mainly had the expression in liver， brain， head kidney and monocytes/macrophages. Upon Vibrio anguillarum infection， the mRNA expression of gene Arg-II significantly up-regulated in the liver， brain， head kidney and monocytes/macrophages. In summary， our present study revealed a tight relationship between the ayu Arg-II expression and V. anguillarum infection， suggesting that ayu Arg-II plays an important role in fish immune response against bacterial infection. This study provides a theoretical basis for studying the functions of fish Arg-II， and its molecular mechanism in regulating fish immune response to pathogens.

Plecoglossus altivelis；arginase II；Vibrio anguillarum；monocytes/macrophage；expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.014

2015-03-28

国家自然科学基金项目（31402333），浙江省自然科学基金项目（LQ13C190002），高等学校博士学科点专项科研基金项目（20133305120008）

丁斐斐，女，研究方向：鱼类分子免疫学；E-mail：dingfeifei14@163.com

李长红，女，研究方向：鱼类分子免疫学；E-mail：lichanghong0716@163.com