一株耐高温菌CICC 10853的分离和鉴定

都海渤 张欣 李赞 刘毅 刘波 李金霞 姚粟 程池

（中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015）

一株耐高温菌CICC 10853的分离和鉴定

都海渤 张欣 李赞 刘毅 刘波 李金霞 姚粟 程池

（中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015）

从斜面培养基中分离到一株耐高温菌CICC 10853，对该菌株的分类地位进行了研究。通过形态学、生理生化特征、16S rRNA和recN基因序列分析的多相鉴定技术，将其鉴定为噬热地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans），为后续对该菌的生物学功能研究奠定基础。

高温菌；CICC 10853；鉴定

在微生物学研究中，高温菌也称嗜热菌或好热菌，具有嗜热和耐热的特性［1］。由于高温微生物及其活性物质可以在高温条件下行使功能，具有超常的生物学稳定性，能够实现一般生物技术难以达到的目的。高温菌的利用有助于突破当前生物技术领域中的一些局限，为提高生物技术能力开辟了重要途径，因此在生物技术领域具有重要的应用潜力，特别是嗜热酶作为酶制剂具有制备成本低、动力学反应快、热稳定性好等优点［2］，在轻工、食品、化工等众多领域都得到了广泛应用［3］。

高温菌在地球上分布广泛，不仅存在于地热环境中，在人工高温环境、地下油层甚至空气中都曾发现有高温菌的存在，但通常分布在陆地温泉、海底热泉、地壳内部、酸性硫磺区等自然高温环境中及高温堆肥、烟囱、热水器、热污染河流等人工高温环境中［4］。本研究从经121℃灭菌20 min的斜面培养基中分离到一株高温菌CICC 10853，通过表型、生理生化、16S rRNA基因和recN基因序列分析的多相鉴定技术确定该菌株的分类学地位，旨在为进一步了解其生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 CICC 10853分离于CICC实验室的斜面培养基。

1.1.2 R2A培养基 酵母粉 0.5 g，蛋白胨 0.5 g，酪蛋白水解物0.5 g，葡萄糖 0.5 g，可溶性淀粉 0.5 g，丙酮酸钠 0.3 g，磷酸氢二钾 0.3 g，硫酸镁0.1 g，琼脂 15.0 g。蒸馏水 1.0 L，pH7.2。121℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离与纯培养 R2A培养基分装试管，121℃灭菌20 min，冷却至50-55℃摆斜面，凝固后置于37℃培养箱空置培养2 d，确认无菌。在56℃培养48 h，长出菌落后，利用R2A平板划线培养，挑取单菌落转接到新鲜的R2A斜面培养后于4℃保藏。

1.2.2 形态学观察 将供试菌株接种于R2A平板上，56℃培养24 h。取新鲜菌体进行革兰氏染色并镜检，染色方法参照《常见细菌系统鉴定手册》［5］。同时进行扫描电镜切片并镜检、拍照。

1.2.3 16S rRNA基因序列分析 利用细菌基因组DNA提取试剂盒（Tiangen公司）提取菌株CICC 10853基因组DNA，具体步骤参见试剂盒说明书。以基因组DNA为模板，利用通用引物F27/1492R扩增16S rRNA基因［6］。测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。测序结果用Chromas软件参照正反序列图谱人工校对，测序结果在EzTaxon数据库中进行比对［7］，确定与已知近缘种序列的相似性。采用CLUSTAL W对CICC 10853及其若干近缘种16S rRNA基因序列进行多序列比对［8］，并利用N-J法通过MEGA 5软件进行系统发育树分析［9］。

1.2.4 recN 基因序列分析 以菌株CICC 10853的基因组DNA为模板，对靶基因recN（DNA修复和基因重组蛋白N亚基基因）进行扩增，PCR及反应条件参照［10］。纯化后的PCR产物由北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。测序得到的结果在GenBank数据库中进行比对分析，并通过MEGA 5软件进行系统发育树分析［9］。

1.2.5 生理生化特征实验 采用API 50CH及API 20E试剂条对CICC 10853 的碳源利用及其产酸情况、酶活性等生理生化特征进行检测，具体操作方法按试剂条使用说明书进行。生长温度实验和耐盐性实验依据《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》［11］（第2版）中地芽胞杆菌属相关内容，温度选择35℃、40℃、45℃、70℃和75℃，NaCl终浓度选择1%、2%、3%、4%和5%。

2 结果

2.1 形态学观察

菌株CICC 10853在R2A培养基上，菌落黄色、不透明、圆形、表面光滑（图1-A）。利用光学显微镜观察显示菌体细胞长杆状，单个或成链状排列。革兰氏染色阳性，有芽胞，芽胞椭圆或柱状、端生或次端生，膨大明显（图1-B）。菌体电子显微镜观察，菌体长度2.0-3.0 μm，宽度0.4-0.6 μm，扫描电镜成像效果见图1-C。

图1 菌株CICC 10853形态学观察结果

2.2 16S rRNA基因序列分析

测序得到的菌株CICC 10853的16S rRNA基因序列信息提交至GenBank，获得登录号KP729021。以Bacillus subtilis NCIB 3610T（ABQL01000001）为外群，构建CICC 10853与相关近缘模式菌株的系统发育树（图2）。

图2 CICC 10853 16S rRNA基因系统发育分析

由系统发育分析可判断，CICC 10853应归属为地芽胞杆菌属（Geobacillus sp.），与好热地芽胞杆菌（Geobacillus kaustophilus）、火神地芽胞杆菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞杆菌（G.lituanicus）、噬热地芽胞杆菌（G.thermoleovorans）、加尔加泉地芽胞杆菌（G.gargensis）和热小链地芽胞杆菌（G.thermocatenulatus）等聚为一个系统发育分支，16S rRNA基因序列相似性均高于原核微生物种的界限98.65%［12］。Dinsdale等［13］根据API、脂肪酸成分、DDH等分析认为好热地芽胞杆菌（Geobacillus kaustophilus）、火神地芽胞杆菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞杆菌（G.lituanicus）、噬热地芽胞杆菌（G.thermoleovorans）应归为同一个种噬热地芽胞杆菌（G.thermoleovorans），另外加尔加泉地芽胞杆菌（G.gargensis）应为热小链地芽胞杆菌（G.thermocatenulatus）的同物异名。

2.3 recN 基因序列分析

recN 基因是地芽胞杆菌属内种间分子生物学鉴定的重要工具［10］。以菌株CICC 10853的基因组DNA为模版，扩增recN 基因，基因序列信息提交至GenBank，获得登录号KP729022。以Bacillus subtilis subsp. subtilis 168T（AL009126）为外群，构建CICC 10853与相关近缘模式菌株的系统发育树（图3）。

recN 基因基因序列分析显示，菌株CICC 10853与好热地芽胞杆菌（Geobacillus kaustophilus）、火神地芽胞杆菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞杆菌（G.lituanicus）、噬热地芽胞杆菌（G.thermoleovorans）的recN基因序列相似度为98.9%，与热小链地芽胞杆菌（G.thermocatenulatus）的序列相似度为97.4%，而与其他近缘种的相似度均低于90%。CICC 10853与好热地芽胞杆菌（Geobacillus kaustophilus）、火神地芽胞杆菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞杆菌（G.lituanicus）、噬热地芽胞杆菌（G.thermoleovorans）的recN基因序列种间相似性均大于99%，这也进一步证明了Anna E. Dinsdale等人的结论。

因此，根据16S rRNA和recN 基因分析表明，CICC 10853应鉴定为噬热地芽胞杆菌（G.thermoleovorans）或热小链地芽胞杆菌（G.thermocatenulatus）。

2.4 生理生化鉴定

菌株CICC 10853的酶活性、碳源利用及其产酸情况等生理生化特征结果详见表1。结果显示菌株CICC 10853液化明胶，β-半乳糖苷酶反应阳性；能利用葡萄糖、果糖、核糖、D-木糖、半乳糖、甘露糖、淀粉、甘油、肌醇、甘露醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、七叶灵等碳源物质，生长温度为45-70℃，培养基中NaCl终浓度1%时可生长，NaCl终浓度2%时不能生长。生理生化结果与噬热地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans）一致。

图3 CICC 10853 recN基因系统发育分析

表1 CICC 10853生理生化特征检测结果

2.5 菌株CICC 10853分类鉴定结论

依据形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA 基因及recN基因序列分析，分离自斜面培养基的菌株CICC 10853被鉴定为噬热地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans）。

3 讨论

2001年，Nazina等［14］提出将芽胞杆菌属16S rRNA系统发育群GROUP 5的嗜热菌群独立出来，形成一个新属地芽胞杆菌属。该属菌种表型相近，革兰氏染色呈阳性（或可变），菌体杆状，芽胞端生。生长温度范围37-80℃。大部分种在自然环境中广泛存在，在温泉、油田、火山口和堆肥等高温环境，甚至土壤常温环境和极地低温环境中均有报道［15］。地芽胞杆菌属正式发表的种共计19个，但近年来随着新种的发现和分子生物学的发展，原有种的分类学地位发生了很大变化，如脆弱地芽胞杆菌G. debilis归属到新属Caldibacillus sp.，命名为C. debilis；苍白地芽胞杆菌G. pallidus、脆弱地芽胞杆菌G. debilis转移到新属Caldibacillus sp.；喜温地芽胞杆菌Geobacillus tepidamans重新归属到无氧芽胞杆菌属Anoxybacillus sp.。好热地芽胞杆菌（G. kaustophilus）、火神地芽胞杆菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞杆菌（G. lituanicus）、噬热地芽胞杆菌（G. thermoleovorans）合并为一个种噬热地芽胞杆菌（G. thermoleovorans），同时加尔加泉地芽胞杆菌（G. gargensis）为热小链地芽胞杆菌（G. thermocatenulatus）的同物异名。截止目前该属仅存12个有效种，4个亚种［16］。

Zeigler［10］对68株地芽胞杆菌的recN 基因序列进行了分析，与16S rRNA基因相比，recN 基因在地芽胞杆菌种水平的鉴定区分度更高。本研究通过16S rRNA和recN 基因序列分析将菌株CICC 10853鉴定为噬热地芽胞杆菌（G. thermoleovorans）或热小链地芽胞杆菌（G. thermocatenulatus），菌株与噬热地芽胞杆菌（G. thermoleovorans）的recN 基因序列相似性（98.9%）高于热小链地芽胞杆菌（97.4%）。进一步综合表型、生理生化等分类特征，CICC 10853被鉴定为噬热地芽胞杆菌（G. thermoleovorans）这也进一步证明了Dinsdale等［13］的结论。

噬热地芽胞杆菌CICC 10853是从经121℃灭菌20 min的斜面培养基中分离获得，可以推测其耐高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20 min不能将其彻底杀灭。该菌在40℃及以下温度不能生长，所以37℃空置培养时未能发现该菌的存在。此外，本研究针对CICC 10853进行碳源物质利用情况及相关酶的活性进行研究，确定其能液化明胶，同时具有β-半乳糖苷酶活性，能利用葡萄糖、果糖、核糖、半乳糖、甘露糖、淀粉及甘油等近20种碳源物质，为进一步开发该菌的生物学功能奠定重要基础。

4 结论

依据多相鉴定技术，分离自斜面培养基的菌株CICC 10853被鉴定为噬热地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans）。

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（责任编辑 李楠）

Isolation and Identification of a High-temperature Resistant Bacterium CICC 10853

DU Hai-bo ZHANG Xin LI Zan LIU Yi LIU Bo LI Jin-xia YAO Su CHENG Chi
（China Center of Industrial Culture Collection，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015）

In this study， we identified the high-temperature resistant bacterium CICC 10853 isolated from slant culture. The strain was identified and characterized via morphological features， physiological and biochemical characteristics， 16S rRNA and recN gene sequence analysis. According to the results， strain CICC 10853 was identified as Geobacillus thermoleovorans， which lays the foundation for the further study of biological function of the bacterium.

thermophilic bacterium；CICC 10853；identification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.018

2015-04-30

都海渤，女，高级工程师，研究方向：微生物学；E-mail：802311820@163.com

程池，男，教授级高工，研究方向：微生物学；E-mail：cheng100027@163.com