枯草芽孢杆菌产芽孢发酵培养基的优化研究

朱晓立，俞巍蔚

枯草芽孢杆菌产芽孢发酵培养基的优化研究

朱晓立1，俞巍蔚2

（1.广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广东广州 510300；
2.广州市蔚林生物科技有限公司，广东广州 510640）

在三角瓶培养条件下，采用单因素实验对枯草芽孢杆菌 B53 发酵培养基碳源、氮源进行了优化。在此基础上进行了正交实验，确定了菌株B53最佳的产孢发酵培养基为葡萄糖25g/L、大豆蛋白胨14g/L、玉米浆17g/L、NaCl 3g/L，MgSO40.2g/ L。在最优条件下发酵培养，芽孢浓度为9.6×109个/mL。

枯草芽孢杆菌；芽孢；发酵培养基；优化

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，革兰氏阳性菌，芽孢（0.6～0.9）×（1.0～1.5）μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大，生长温度：最高温度45～55℃；最低温度 5～20℃。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。枯草芽孢杆菌已广泛应用于畜牧业、酶制剂产业、病虫害防治等领域［1］。通过提高枯草芽孢杆菌芽孢比例，使得活菌制剂的活菌数量得到保障［2］。芽孢具有较好的抗逆性，可以抵抗外界的环境压力，可以提高活菌制剂的稳定性，保证其使用效果［3］。

本研究用的枯草芽孢杆菌是能生产碱性蛋白酶的菌株，可有效降解饲料中的某些抗营养因子，提高饲料转化率。这株枯草芽孢杆菌具有广阔的发展前景，能在农业生物防治、畜牧、水产养殖等方面广泛应用，产生一定的社会效益和生态效益。

1　材料与方法

1.1菌株

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis B53由广东轻工职业技术学院食品与生物工程系保存。

1.2培养基

平板培养基：葡萄糖1g/L，酵母膏0.5g/L，大豆蛋白胨1g/L，MgSO40.2g/L，琼脂20g/L

种子培养基：蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，可溶性淀粉5g/L，MgSO40.2g/L

摇瓶基础培养基：葡萄糖10g/L，NaCl 3g/L，大豆蛋白胨5g/L，MgSO40.2g/L

以上培养基pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。

1.3培养方法

种子培养：从斜面中勾取一环菌种接入装有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，振荡培养24h。

摇瓶培养：取3mL种子液接入已装有27mL摇瓶培养基的三角瓶中（接种量为10%），放在摇床中，150r/min，37℃振荡培养6h后，每隔3h取一次样进行稀释涂布，进行单因素探究。

1.4菌体及芽孢计数

采用平板稀释涂布法测菌数；80℃水浴15min，用平板稀释法检测芽孢生成量。

1.5单因素实验

1.5.1最佳碳源的确定

分别用玉米淀粉，果糖，木糖，乳糖，糖蜜，蔗糖等代替1.2中的摇瓶基础培养基中的葡萄糖，其中相对分子质量保持一致，其他组分均相同，采用摇瓶发酵培养，用稀释平板计数法来测定发酵液中菌数和芽孢数，确定最佳碳源。

1.5.2最佳碳源浓度的确定

在确定好最佳碳源后，选取碳源浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%，进行最佳碳源浓度的确定。培养方法同1.3，检测方法同1.4。

1.5.3最佳氮源的确定

分别用尿素，硫酸铵，柠檬酸铵，酵母粉，玉米浆，NH4H2PO4，（NH4）2HPO4等代替1.2中的摇瓶基础培养基中的大豆蛋白胨，其中相对分子质量保持一致，其他成分均相同，采用摇瓶发酵培养，用稀释平板计数法来测定发酵液中菌数和芽孢数，确定最佳氮源。

1.5.4最佳氮源浓度的确定

在确定好最佳氮源后，选取氮源浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%，进行最佳氮源浓度的确定。培养方法同1.3，检测方法同1.4。

1.6正交试验设计

利用筛选出的一种碳源，以及两种氮源，设计三因素四水平。摇瓶培养到第24h取样检测。培养方法同1.3，检测方法同1.4。

2　结果与讨论

2.1单因素实验

2.1.1碳源种类及碳源浓度对芽孢数量的影响

7种碳源对枯草芽孢杆菌芽孢生成影响如表1所示。单糖容易利用，二糖和多糖要经过微生物水解为单糖才可被微生物利用，所以在相同时间内菌体生长和芽孢生成的速度有所不同，单糖作为碳源时菌体生长较快。

表1　不同碳源对菌体芽孢生成的影响

木糖和乳糖作为唯一碳源时，菌体芽孢生成很少，最高仅能达到106，说明这两种碳源不能被菌体较好的利用，促进菌体生长和芽孢生成。糖蜜、果糖、蔗糖和玉米淀粉作为唯一碳源，菌体芽孢虽然能达到107，但是培养时间较长。葡萄糖作为唯一碳源，菌体芽孢生成速率较快，12h达到108，15h峰值达到6.2×108个/mL。在7种碳源中，葡萄糖极易被菌体利用，有利于芽孢产生，是最佳碳源。

选取不同浓度葡萄糖进行菌体芽孢生成结果，如表2所示。20g/L葡萄糖条件下，芽孢在15h达到9.3×108个/mL。随着葡萄糖浓度增加，芽孢生成量总体下降，40g/L 和50g/L时，芽孢数量级仅达到107。葡萄糖浓度过高，对菌体芽孢的生成有抑制作用。因此，选取20g/L葡萄糖浓度进行后续研究。

表2　不同碳源浓度对菌体芽孢生成的影响（葡萄糖）

2.1.2氮源种类及氮源浓度对芽孢数量的影响

9种氮源对枯草芽孢杆菌芽孢生成影响如表3所示。尿素、（NH4）2HPO4、柠檬酸铵做为唯一氮源，在培养期间最高芽孢浓度的数量级相对很低，说明多摩尔数的NH4+不利于菌体利用，生成芽孢。氯化铵和硫酸铵作为唯一氮源，芽孢浓度最高能达到107，NH4H2PO4作为唯一氮源达到2.1×108个/mL，但是相对有机氮源仍然较低。大豆蛋白胨、玉米浆、酵母粉做为作一氮源时，培养12h后芽孢浓度数量级均能达到108，大豆蛋白胨15h芽孢浓度达到最高的6.2×108个/mL，玉米浆18h芽孢浓度达到最高的7.5×108个/mL，而酵母粉芽孢最高浓度仅为3.0×108。大豆蛋白胨和玉米浆都富含蛋白质和氨基酸，对菌体的生长都起到很大的作用，是饲料行业较为理想的选择，而玉米浆中含有生物素，在制药行业中可用于抗生素的生产，对菌体的生长也起到了很好的保障。因此，选取大豆蛋白胨和玉米浆作为最佳氮源。

表3　不同氮源对菌体芽孢生成的影响

表4　不同氮源浓度对菌体芽孢生成的影响（大豆蛋白胨）

表5　不同氮源浓度对菌体芽孢生成的影响（玉米浆）

15g/L玉米浆条件下，芽孢浓度在18h达到7.3×108个/mL。随着玉米浆浓度增加到20g/L，芽孢生成量总体下降，芽孢最高浓度推达到3.7×108个/mL。因此，选取15g/L玉米浆浓度进行后续研究。

2.2正交试验设计

将筛选出的最优碳源、两个氮源为三因素，设计三因素四水平，其中葡萄糖：10g/L、15g/L、20g/L、25g/L，大豆蛋白栋8g/L、10g/L、12g/L、14g/L，玉米浆13g/L、15g/L、17g/L、19g/L，共16瓶，培养24h取样进行芽孢检测。结果如表6所示。

表6　正交试验菌体芽孢生成量 　 g/L

从结果可以看出，三个因素对菌体芽孢生成量影响的顺序为：玉米浆＞大豆蛋白＞葡萄糖经过极差分析得出，有利于芽孢生成的因素组合：葡萄糖25g/L、大豆蛋白胨14g/L、玉米浆17g/L。

3　结论

采用单因素的探究和正交试验来对枯草芽孢杆菌进行摇瓶培养，通过稀释平板法来测定发酵液中芽孢数。单因素研究从7种碳源和9种氮源中选取葡萄糖、大豆蛋白胨和玉米浆。正交试验优化后菌体芽孢最多的培养基为：葡萄糖25g/L、大豆蛋白胨14g/L、玉米浆17g/L，NaCl 3g/L，MgSO40.2g/L。在此条件下的重复实验结果，24h菌体芽孢达到9.6×109个/mL。

［1］ 赵朋超，王建华，权春善，等.枯草芽孢杆菌抗菌肽生物合成的研究进展［J］.中国生物工程杂志，2010，30（10）：108-113.

［2］ 甄静，郭直岳，谢宝恩，等.枯草芽孢杆菌XK-1产芽孢条件的优化［J］.中国农学通报，2012，28（27）：146-151.

［3］ 郭夏丽，狄源宁，王岩，等.枯草芽孢杆菌产芽孢条件的优化［J］.中国土壤与肥料，2012，（03）：99-103.

Study on Optimization of Spore Production in Fermentation Medium about Bacillus subtilis B53

Zhu Xiao-li，Yu Wei-wei

The carbon and nitrogen sources were optimized by single factor experiment under the condition of triangular flask culture.On the basis of the orthogonal experiment，the optimum fermentation medium of strain B53 was determined（glucose 25g/ L，soybean peptone 14g/L，corn syrup 17g/L，NaCl 3g/L，MgSO40.2g/L）.Under the optimum conditions，the spore concentration was9.6×109/m L.

Bacillus subtilis；spore；fermentation medium；optimization

S816.3

A

1003-6490（2016）06-0105-02

2016-06-06

广东轻工职业技术学院企业横向项目（HX2011-002）。

朱晓立（1980—），男，河北唐山人，高级工程师，主要研究方向为为发酵工程。