利用纳米金颗粒作为指示剂的胰岛素水解模拟过程监测分析

朱黎琴，俞明华，江宇峰，朱春莲

利用纳米金颗粒作为指示剂的胰岛素水解模拟过程监测分析

朱黎琴1，俞明华2，江宇峰3，朱春莲3

（1.义乌市水处理有限责任公司，浙江义乌 322000；
2.嘉善绿野环保材料厂，浙江嘉兴 314000；
3.浙江水知音检测有限公司，浙江嘉善 314100）

利用7～10nm的纳米金颗粒作为指示剂，利用胰蛋白酶作为水解酶，建立了体外胰岛素水解模拟过程，并实现了对胰岛素体外水解模拟的检测。利用透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察了纳米金颗粒与胰岛素分子的作用和胰蛋白酶水解胰岛素后的形态变化，证实了体外水解的发生过程，最后使用紫外吸收法测定了胰岛素体外水解的程度。

胰岛素；胰蛋白酶；纳米金；水解；检测

胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素［1-3］。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。因此，检测和监测生物体内胰岛素的水解过程是生化分析检测研究中的一个重要的研究内容［4-6］。本文提出一种新型的利用纳米金颗粒作为指示剂的胰岛素水解模拟过程监测分析方法，能够快速简便地开展胰岛素体外水解模拟分析。

1　实验过程

1.1实验材料和仪器

氯金酸，柠檬酸钾，硼氢化钠，十六烷基三甲基溴化铵，抗坏血酸溶液，PBS缓冲溶液均购于国药试剂有限公司（上海）；胰岛素（Insulin），胰蛋白酶（trypsin）购于上海生工生物。

透射电子显微镜（TEM）Hitachimodel H-800（工作电压100 kV）和扫描电子显微镜（SEM）Quanta 400F用来表征胰岛素-纳米金体系形态；紫外-可见分光光度计UV-1700 PharmaSpec UV-Vis spectrophotometer（日本岛津公司）用来测定溶液的紫外吸；pH510精密酸度计（美国优特公司）用于调节缓冲溶液的pH值。

1.2纳米金颗粒的合成

配制0.01mol/L氯金酸，0.01mol/L柠檬酸钾，0.1mol/L硼氢化钠，0.1mol/L十六烷基三甲基溴化铵和0.1mol/L抗坏血酸溶液。在锥形瓶中加入18.5mL去离子水，0.5mL氯金酸溶液和0.5mL柠檬酸钾溶液，搅拌分散5min。搅拌下缓慢加入0.5mL硼氢化钠溶液，随着硼氢化钠的加入溶液的颜色逐渐发生变化。反应结束可得到平均粒径为7～10nm的金溶胶种子溶液。

1.3胰岛素水解分析监测

胰岛素溶解，选择 0.2M NaOH和HCl分别溶解，得到1mg/ mL 的溶液。所得的胰岛素溶液在4℃下可保存10h。

纳米金颗粒修饰：将所制备的胰岛素溶液与等体积的纳米金颗粒溶液混合，充分振荡，超声，并静置5h。得到待分析的insulin@Au溶液。

体外水解模拟实验：用0.05M 的PBS缓冲溶液配制0.1mg/ mL的胰蛋白酶溶液，分别取10µL，50µL和100µL加入到配制好的insulin@Au溶液中，室温下进行水解反应24h。

电子显微镜实验：将上述各种溶液离心（10 000转，10min），分离上层清夜，并且将离心得到的沉淀再次溶解于初始体积的纯水中。得到的样品分别进行UV，SEM 和 TEM的实验。

2　结果与讨论

2.1胰岛素-纳米金及胰岛素-胰蛋白酶水解体系的建立

如图1所示，蓝色线条为纳米金溶液的紫外吸收图，从图中可以看出实验合成的纳米金颗粒在520nm处有明显的吸收峰，而红色线条为实验配制的胰岛素溶液的紫外吸收图。从图中够可以看出胰岛素溶液在300～800nm范围内并没有明显的紫外吸收，纳米金的特征吸收峰和胰岛素溶液的无干扰为本实验的顺利开展奠定了基础。当胰岛素分子与纳米金颗粒相互作用后，特征吸收峰明显红移，如图1 中的绿色线条所示，但是峰强度保持不变。当向溶液中加入胰蛋白酶后，峰强度发生明显下降，如图1 纳米金颗粒（蓝线），胰岛素溶液（红线），胰岛素-纳米金颗粒（绿线）和经胰蛋白酶水解后的胰岛素-纳米金溶液（黑线）的紫外吸收谱图中黑线所示，并且特征峰的最大吸收波长由553nm 移至542nm处，证明了水解的发生。

图1　纳米金颗粒（蓝线），胰岛素溶液（红线），胰岛素-纳米金颗粒（绿线）和经胰蛋白酶水解后的胰岛素-纳米金溶液（黑线）的紫外吸收谱图

3.2TEM和SEM对于胰岛素-纳米金及胰岛素-胰蛋白酶水解体系的表征

我们采用TEM和SEM对所建立的胰岛素-纳米金及胰岛素-胰蛋白酶水解体系进行了表征。如图2中的A图所示，我

们利用化学还原法制备的纳米金颗粒形态清晰，尺寸在7～10 nm之间。当纳米金颗粒与胰岛素分子相互作用后形成了如图2B所示的形貌。纳米金颗粒的尺寸和聚集程度发生了明显的变化。与纳米金颗粒连接的胰岛素在胰蛋白酶的作用下水解，我们发现由于水解的作用，导致均匀分布的胰岛素-纳米金颗粒的大部分发生了纳米金颗粒的脱落，其中一些金团聚并且沉积在水解产物当中（图2C）。SEM的表征进一步验证了我们的设想和实验的方法。当纳米金与胰岛素连接之后，颗粒清晰的圆形表面状态消失，取而代之的是由于蛋白质吸附而形成的絮状的无规则的连接体。当胰蛋白酶加入发生水解反应后，可以看出大量的水解产物包裹住了纳米金的颗粒，我们很难观察到纯纳米金颗粒时的状态。TEM和SEM的表征实验成功的证实了本论文提出的基于纳米金颗粒作为指示剂的胰岛素体外水解分析方法的可行性。

图2　（A）纳米金颗粒（粒径7～10 nm），（B）胰岛素-纳米金和（C）经胰蛋白酶水解后的胰岛素-纳米金颗粒的透射电子显微镜照片

3.3胰岛素-纳米金-胰蛋白酶水解体系的监测

我们采取紫外吸收法，利用测定纳米金颗粒与胰岛素相互作用吸附后形成的聚集体仍然具有紫外吸收特征的原理，对利用胰蛋白酶作为水解动力的体外胰岛素水解模拟体系进行监测。当向体系中分别加入10，50和100µL的0.1mg/mL胰蛋白酶溶液后，位于542nm处的特征峰强度逐渐下降，说明了水解进行的程度越来越强，同时进一步证明了本方法的可行性。

4　结束语

通过实验提出了基于纳米金颗粒的胰岛素-胰蛋白酶水解体系模拟监测体系，利用TEM，SEM和紫外吸收分光光度法对方案进行了证实研究。实验结果表明，利用纳米金颗粒能够很好的监测体外模拟状态下的胰岛素水解程度，为胰岛素的分析检测领域提供了有效的研究方法和创新的研究思路。

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［6］ R.S.Yalow，S.A.Berson，Nature 184（1959）1648.

Monitoring and Analysis of the Simulation Process of Insulin Hydrolysis Using Gold Nanoparticles as Indicator

Zhu Li-qin，Yu Ming-hua，Jiang Yu-feng，Zhu Chun-lian

Uses gold nanoparticles 7-10nm as an indicator，as the hydrolase trypsin，established in vitro insulin hydrolysis simulation process，and realize the simulation for the detection of insulin in vitro hydrolysis.Using transmission electron microscope and scanning electron microscope to observe the morphological changes of gold nanoparticles and insulin molecules and Trypsin Hydrolysis after insulin，confirmed the in vitro hydrolysis process，and finally the use of UV absorption method for the determination of insulin in vitro hydrolysis degree.

insulin；trypsin；gold nanoparticles；hydrolysis；detection

R914

A

1003-6490（2016）06-0104-02