TALENs新型模块组装法及活性鉴定方法

高敬魏迪池振奋张癸荣张万明聂凌云

（1.河北北方学院，张家口 075000；2.中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所，北京 100166；3.中国科学院北京基因组研究所，北京 100101）

TALENs新型模块组装法及活性鉴定方法

高敬1，2魏迪1，2池振奋3张癸荣1，2张万明1聂凌云1，2

（1.河北北方学院，张家口 075000；2.中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所，北京 100166；3.中国科学院北京基因组研究所，北京 100101）

旨在提供一种新型的转录激活样效应子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）模块组装法（Unit assembly，UA）及活性鉴定方法。利用TALE-NT 2.0在线工具在线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）设计TALENs识别位点和剪切位点，借助pEGFP-N1质粒将该段靶序列随机整合于HEK293F核基因组中，构建HEK293F-T1细胞系，用于TALENs活性鉴定。依据转录激活样效应子（Transcription activator-like effectors，TALEs）自然单元模块序列，设计出一种新型的人工TALEs偏单元；根据TALENs识别位点，选取相应一单元模块，利用UA法组装；并设计出含有相应双酶切位点的TALEs串联模块序列和TALENs载体序列，定向连接后瞬时转染HEK293F-T1细胞系。结果显示，新型模块组装法定向组装TALEs模块，克隆效率高且瞬时转染后可看到清晰的套峰。结果表明，新型模块组装方法提高了TALENs构建过程中的克隆效率，并且不受末位0.5模块的RVD（repeat-variable diresidue）限制，增加了靶序列设计的灵活性。

转录激活样效应子核酸酶；模块组装法；线粒体DNA；HEK293F-T1

现阶段最常用的三大基因编辑技术主要有锌指核酸酶技术（Zinc finger nucleases，ZFNs）、转录激活样效应子核酸酶技术（Transcription activatorlike effector nucleases，TALENs）、CRISPR/Cas9技术（Clustered regularly interspaced short palindromic Repeats/Cas9 nuclease）［1］。其中TALENs技术具有无上下文效应［2］、脱靶效率低于ZFNs技术和CRISPR/Cas9技术［3］、特异性高等优点，现已成为一种广泛应用的基因定点修饰技术。

TALENs由转录激活样效应子蛋白（Transcription activator-like effector，TALE）、识别域和FokIⅡ核酸酶及切割域组成［4］。其中，TALE蛋白源自黄单胞杆菌，一般由N端、C端和中央串联重复模块组成，N端包含Ⅲ型转运信号（Translocation signal）；C端包含核定位信号（Nuclear localization signal，NLS）和酸性转录激活域（Activation domain，AD）；中央重复模块具有“一模块识别一碱基”的特点，且没有上下文效应，其结构高度保守，一般由34个氨基酸组成，仅在12和13位高度可变，又称这两位的氨基酸为RVD（Repeat-variable diresidue）［2，5，6］。本研究采用并改造TALENs的精简处理的骨架，即N端包含136个氨基酸，C端包含63个氨基酸，且C端融合有FokIⅡ型核酸内切酶［7-10］。利用TALENs这些结构特点可以构建识别任何DNA序列的TALENs，包括核基因组和线粒体基因组［11，12］。

在TALENs应用中，TALENs的中央重复模块的组装是限速步骤，目前为止，最常用的TALENs构建方法大体可分为Golden Gate法［13-16］、FLASH（Fast Ligation-based automatable solid-phase highthroughput）法［17，18］、模块组装法（unit assembly，UA）法［7］及其他方法，如LIC法（Ligationindependent cloning）［19］、ICA法（Iterative capped assembly）［20］、idTALE法［21］、REAL法（Restriction enzyme and ligation）［22］等。其中Golden Gate法、FLASH法最为省时，然而这两种方法存在的酶切连接效率问题或因PCR技术的限制性而出现非特异的问题难以避免，相比之下，UA法虽构建时间较长，但TALENs编码序列可控且没有上述问题，同时可以根据密码子简并原则改变TALEs编码序列，降低TALENs重复模块编码序列的重复性，降低mRNA的重复性，有助于提高TALENs在真核细胞内表达效率。本研究提供了TALENs的一单元模块编码序列库，并改造表达载体pCS2-peas/perr，利用UA法定向组装TALENs。鉴于目前没有报告清晰的介绍线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）双链断裂（Double-strand breaks，DSB）的修复机制，本研究将mtDNA靶序列随机整合于核染色体中，利用核基因组的同源重组（Homologous recombination，HR）和非同源末端连接（Non-homologous DNA end joining，NHEJ）修复方式［23］，以检测新型模块组装法构建的TALENs活性，旨在为编辑mtDNA提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 HEK293F细胞为本实验室保存。

1.1.2 试剂和引物 Xba I、Nhe I、AsiS I、Sac I、BamH I等限制性核酸内切酶购自NEB公司；质粒小提试剂盒购自北京庄盟国际生物公司；高纯度小提中量试剂盒购自天根生物科技公司；HA、Flag、β-actin抗体购自Sigma公司；Anti-Rabbit、Antimouse抗体购自CST公司；转染试剂X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent购自Roche公司；DMEM高糖培养基购自Invitrogen公司；胎牛血清购自Biowest公司；pUC19、pEGFP-N1质粒由本实验室保存；pCS2-peas/perr质粒购自康为世纪公司；所有引物序列（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；测序由华大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养 HEK293F细胞以及HEK293FT1细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养于37℃、5%CO2温箱中。

1.2.2 pCS2-peas/perr载体骨架的改造 本研究于载体0.5单元的RVD编码序列两侧分别构建AsiS I和Xba I酶切位点，如图1所示。实验方法如下：以pCS2-peas/perr载体质粒为模板，TALEN0.5_N-F/R为引物对，扩增得到全长质粒对，PCR产物经DpnI酶切，转化后挑单克隆菌落，pCS2-NF/CR引物对测序鉴定出阳性质粒，最终得到载体质粒pCS2-0.5U-peas/perr。

1.2.3 TALEs一单元模块的构建 基于TALEs自然单元模块序列［6］和UA法的人工单元模块序列［7］，本研究设计的人工单元模块序列命名为偏单元（图2），起始于TALEs自然模块的+19位氨基酸残基Leu，终止于下一个自然模块的+18位氨基酸残基Ala。于偏单元序列的两端分别构建Xba I、Nhe I同尾酶识别位点，于RVD区附近构建AsiS I酶切位点。根据AsiS I酶切位点的有无分为活动一单元模块（含AsiS I酶切位点）和固定一单元模块（不含AsiS I酶切位点）。活动一单元模块位于TALEs重复模块的首位，并命名为0序列，依次标记为A0、C0、G0、T0。固定一单元模块位于第2位及后续位置。由于氨基酸密码简并性和第4位、32位氨基酸残基的高度可变，TALEN模板序列数目模大，经排列组合计算后结果如表2所示。选取了氨基酸序列一致的4种基本骨架a1、c1、g1、t1，碱基序列不同但差异率并非最大（折中差异性），N-LETVQRLLPVLCQ AHGLTPEQVVAIASNIGGKQA-C（灰色背景部分为RVD区）。依次构建含有4种RVD（NI、HD、NN、NG）的一单元模块，依次标记为A1、A2、A3、A4，C1、C2、C3、C4，G1、G2、G3、G4，T1、 T2、T3、T4，如表3所示。

表1 pCS2-0.5U-peas/perr构建所需引物

图1 pCS2-0.5U-peas/perr构建示意图

活动单元的构建以C0序列为例，构建方法如下：以C0的DNA编码序列（表3）为模板分别合成Oligo片段C0-L1、C0-L2和C0-S1、C0-S2（表4），C0-L1/C0-L2、C0-S1/C0-S2分别退火，得到片段C0-L、C0-S，对pUC19质粒进行BamH I/Sac I双酶切，将片段C0-S连入，再次进行Xba I/AsiS I双酶切，将片段C0-L连入，得到包含C0序列的pUC19-C0质粒（图3）。合成A0-S1/A0-S2、G0-S1/G0-S2（NN）、T0-S1/T0-S2（序列见表4），两两退火后，分别连入AsiS I/Nhe I双酶切后的pUC19-C0偏单元载体，得到分别包含A0、G0和T0序列的质粒pUC19-A0、pUC19-G0、pUC19-T0。从合成方法来看，A0、C0、T0和G0序列除了RVD区编码序列不同外，其他位置编码序列均相同。

固定单元的构建以A1为例，构建方法如下：根据A1的DNA编码序列（表3），合成Oligo片段A1-L1、A1-L2和A1-S1、A1-S2（表5），分别退火，得到片段A1-L、A1-S。以A1-L1和A1-S2为引物，A1-L、A1-S为模板，扩增得到A1。以A1为骨架，RVD区分别换为其他3种RVD（HD、NN和NG）的编码序列，可得到C2、G2和T2。其他模块构建方法为，将A1-S2的RVD去分别改为其他3种RVD（HD、NN和NG）的编码序列，命名为C2-ar、G2-ar和T2-ar（表5），分别和A1-L1组成引物对，以A1为模板，扩增得到C2、G2和T2。最终得到A1、C1、G1、T1，A2、C2、G2、T2，A3、C3、G3、T3，A4、C4、G4、T4。

设置射频通道的本振频率前，先设置多功能管脚为锁相环锁定检测管脚，将鉴相器增益还原为默认值；由于未使用到芯片内 IF锁相环，则关闭IF锁相环电源；开启RF锁相环电源。

图2 TALEs偏单元的氨基酸序列示意图

表2 TALE一单元模块排列组合计算表

表3 0序列与4×4一单元模块序列表

1.2.4 靶序列的选择与TALEs中央重复模块的组装 在NCBI查询得到人线粒体DNA序列（NC_012920.1），利用TALE-NT 2.0（TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0）设计一系列TALENs靶序列。经过靶位点比对和筛选，本研究选取选择线粒体DNA（NC_012920.1）的16347-16387位为靶序列，5'-TCAAATCCCTTCTCGTCCCCATGGATGACCC CCCTCAGA TA-3'，并依据该靶序列设计TALEs的串联重复模块。本研究设计选取12.5个TALEs模块，Left-arm：5' -CAAATCCCTTCTC-3'；Right-Arm：5'-ATCTGAGGGGGGT-3'。

图3 TALEs偏单元重复模块的碱基序列设计示意图

表5 4×4序列构建中所需oligo序列表

用Nhe I/Sac I和Xba I/sac I分别对模块载体和目的模块序列进行酶切、连接，依次由一单元得到二单元，得到四单元，再根据设计序列进行灵活连接［7］。本研究组构建的三单元模块库，分别由4个三单元模块两两相连，得到2个六单元模块，再次相连后与活动一单元连接，最后得到13单元TALE-13U，Left-arm的构建如图4所示，然后将其进行AsiS I和Nhe I（Xba I的同尾酶）双酶切，连接入pCS2-0.5U-peas/perr载体，得到pCS2-12.5U-L/R质粒对。

图4 TALE-13U构建示意图

1.2.5 HEK293F-T1细胞系的构建 合成5'端和3'端分别含有Nhe I、Age I酶切位点的靶序列片段，分别对靶序列片段和pEGFP-N1质粒进行Nhe I/Age I双酶切后，将二者进行连接、转化，挑取单克隆菌落，经PCR检测，测序验证含有靶序列的目标质粒，转染培养于35 mm dish的HEK293F细胞，24 h后消化转移至10 cm dish培养，同时加G418筛选，在推荐药物浓度附近设置浓度梯度，经摸索得到G418的最适浓度为1 mg/mL。挑取单克隆细胞系，继续培养，经PCR扩增并测序，得到整合有靶序列的目标细胞系，标记为HEK293F-T1。

1.2.6 TALENs在细胞内表达活性的检测 将HEK293F-T1细胞接种于两个10 cm dish中，待两盘细胞长至生长对数期且细胞密度一致（约24 h），选取其中一盘细胞瞬时转染1.2.4中构建的质粒对pCS2-12.5U-L/R，另一盘作为control，再继续培养48 h，收细胞，提取基因组，PCR扩增后测序鉴定打靶效果。PCR反应为活性检测的关键步骤，反应体系为：基因组（模板）200 ng，上/下游引物各0.5μL，LA Taq 0.5 μL，10×LA PCR BufferⅡ 2.5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL，ddH2O补足至25 μL。反应程序：95℃ 2 min；95℃ 15 s、60℃ 30 s，72℃ 1 min（35个循环）；72℃ 5 min。

2 结果

图5 mtDNA中靶序列测序峰图

图6 HEK293F-T1基因组中靶序列测序峰图

2.1 靶序列的确定

2.1.1 HEK293F细胞线粒体中靶序列的确定 依据线粒体DNA（NC_012920.1），在靶序列附近设计引物，以提取的HEK293F基因组为模板，扩增含有靶序列的片段并测序，测序结果峰图如图5所示。

2.1.2 细胞系HEK293F-T1中靶序列的确定 提取HEK293F-T1细胞基因组并作为模板，在pEGFPN1-T1质粒靶序列两侧设计引物，扩增靶序列，测序结果峰图6如图所示。

2.2 TALENs的构建及酶切鉴定

模块组装法组装TALENs，构建得到pCS2-12.5U-L/R质粒，经AsiS I/BamH I酶切鉴定，片段为1 448 bp，大小如图7-A所示，测序结果经Blast比对，左右臂的氨基酸比对结果如图7-B所示。

2.3 TALENs活性检测

通过提取瞬时转染pCS2-12.5U-L/R质粒的HEK293F-T1基因组，扩增、测序分析后，观察到靶序列强峰下出现套峰，结果（图8）表明，TALENs成功的作用于HEK293F-T1基因组上的靶序列，造成双链断裂后，在细胞核内进行了修复。

3 讨论

3.1 TALENs编码序列重复性与活性

TALENs识别域是由n个串联的高度重复的模块组成，在细胞转录与翻译过程中，能否对高度重复的序列十分准确的转录翻译成重复的蛋白模块，至今还未有研究组论证，本研究组尝试着尽量降低TALENs编码序列的重复性，而模块组装法恰好能够保证构建的TALENs编码序列的高保真性［24］，使得TALENs编码序列重复性可控，提高了TALENs的表达效率。

3.2 针对mtDNA的相关编辑研究

因mtDNA的碱基序列长度远远小于nDNA（Nuclear DNA），且线粒体中针对双链断裂的修复机制尚未准确解析。本研究组中将mtDNA序列整合于核基因组中，利用核基因组中的HR和NHEJ机制对其进行修复，同时考虑到TALENs中央重复模块的数目是否会影响打靶效率，本研究中设计的TALENs均选取12.5个重复模块，对nDNA打靶效果比较理想，进而为mtDNA的编辑研究奠定了基础。Bacman［12］实验组首次利用TALENs编辑mtDNA的相关研究，为本实验室提供了可参考的思路与方法，本实验组下一步将进行mtTALENs（Mitochondriatargeted TALENs）的研究。

图7 pCS2-12.5U-L/R质粒酶切（A）及pCS2-12.5U-L质粒测序比对（B）结果

图8 pCS2-12.5U-L/R打靶结果图

4 结论

本研究中提供的新型模块组装法可定向的组装TALENs，提高克隆效率，并增加了靶位点设计的灵活性，在表达强度和打靶效果上均可达到理想效果。

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（责任编辑李楠）

A Novel Method of Unit Assembly and Activity Assay for Transcription Activator-like Effector Nucleases

GAO Jing1，2WEI Di1，2CHI Zhen-fen3ZHANG Gui-rong1，2ZHANG Wan-ming1NIE Ling-yun1，2
（1. Hebei North University，Zhangjiakou 075000；2. Institute for Drug and Instrument Control，Health Department，the General Logistics Department of People’s Liberation Army，Beijing 100166；3. Beijing Institute of Genomics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101）

A novel method of unit assembly（UA）and activity assay based on transcription activator-like effector nucleases（TALENs）are described. An online tool TALE-NT 2.0 was used to design recognition and splice sites on mitochondrial DNA（mtDNA）of TALENs. By means of pEGFP-N1 plasmid， the segments of target sequence were randomly integrated in the nuclear genome of HEK293F. The constructed cell line HEK293F-T1 was for activity assay of TALENs. Based on transcription activator-like effector（TALE）natural repeats， a new type of artificial TALEs single-unit repeats were designed. According to the recognition sites of TALENs， appropriate single-unit repeats were selected and assembled by UA. TALEs series unit sequence containing the corresponding double enzyme cutting sites and TALENs vector sequence were designed， which was directionally ligated and transiently transfected into HEK293F-T1 cell line. The results showed that the TALES units were directionally assembled by new method， and it had a high cloning efficiency；moreover， the nested peaks clearly appeared after transient transfection. In conclusion， the novel method of unit assembly improves cloning efficiency of constructing TALLENs， even is not limited by repeat-variable residue（RVD）in the last 0.5 unit， and increases the flexibility of designing the target sequences.

transcription activator-like effector nucleases；unit assembly；mitochondrial DNA；HEK293F-T1

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.035

2015-03-04

国家自然科学基金面上项目（31371346）

高敬，女，硕士研究生，研究方向：遗传学研究新技术与新方法；E-mail：gaojing201201@126.com

聂凌云，女，博士，研究方向：遗传学研究新技术与新方法；E-mail：nielingyun@126.com