螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化方法研究进展

付丽丽 那日 郭久峰 金晶

（内蒙古大学自治区离子束生物工程重点实验室，呼和浩特 010021）

螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化方法研究进展

付丽丽 那日 郭久峰 金晶

（内蒙古大学自治区离子束生物工程重点实验室，呼和浩特 010021）

藻蓝蛋白具有抗氧化、增强机体免疫力、抗癌、抗炎及保肝护肝等诸多生理活性，被广泛应用于食品、化妆品及医药等邻域，其提取纯化技术备受关注。列举了近些年藻蓝蛋白的提取纯化技术，比较了一些主要的提取纯化方法的优缺点。

螺旋藻；藻蓝蛋白；提取纯化

螺旋藻中的藻蓝蛋白是一种重要的捕光色素蛋白，在光合作用原初理论研究方面具有很重要的作用，具有更重要的开发利用价值［1］。藻蓝蛋白（Phycocyanin，PC）具有抗癌、抗氧化、治疗脑缺血损伤、提高机体免疫力等多种生理功能，有关 PC的研究已经成为天然海洋药物的研究热点［2］，PC 的提取分离技术也成为时下人们所关注的问题之一。传统的PC分离提纯技术一般通过超声、反复冻融、酶解和高压均质等方法使细胞裂解获得 PC 粗提物，然后将（NH4）2SO4沉淀法与多种色谱层析法结合使用［3］，此类方法存在步骤繁琐、蛋白质损失量较大、难以规模化推广，且高于50%的生产成本用在纯化的过程中等缺点［4］。近几年不断发展起来的新技术如双水相萃取技术、反胶团萃取技术、膨胀床吸附及其一些不同技术结合使用等为藻蓝蛋白的规模化制备提供了新的方法。本文对上述传统方法及其新技术进行了综述，比较了几种主要的提取纯化方法的优缺点，以期为藻蓝蛋白的进步研究与应用提供参考资料。

1 螺旋藻藻蓝蛋白的粗提取

藻蓝蛋白的粗提取过程中细胞破碎是关键，细胞破碎方法的选择是非常重要的［5］。张以芳等［6］用氯化钾溶菌酶法或冻融法破碎螺旋藻细胞壁，应用氯化钾溶菌酶法破壁率高达95%以上，藻蓝蛋白得率可达13.1%；冻融法破壁只适宜于处理少量样品，大剂量螺旋藻样品很难快速冻融，提取率达11.8%。表明酶法破壁适应于大量藻蓝蛋白制备，冻融法只适应于小量制备。李冰等［7］用磷酸盐缓冲液循环冻融联合超声波破碎法，提取率达到13.1%。金怡雯等［8］通过响应曲面的方法，对螺旋藻藻蓝蛋白的萃取条件进行优化，结果表明，萃取时间和萃取温度的交互作用对藻蓝蛋白得率的影响最为显著；得到的最佳萃取工艺条件为：质量浓度为2.0 mg/mL、萃取时间为37.14 h、萃取温度为25.61℃，在此萃取条件下得到的藻蓝蛋白得率为13.66%。邵明飞等［9］采用响应曲面法对超声波破壁提取螺旋藻中藻蓝蛋白的工艺条件进行优化，得到的最佳工艺条件为：液料比为21 mL/g，超声波功率为640 W，超声时间为14 min，此条件下藻蓝蛋白的得率为10.76%，与模型预测值10.77% 相近，对超声波提取法、冻融法、恒温浸提法进行比较研究发现，超声波提取法用时短、藻蓝蛋白得率高。

以上粗提取过程中主要采用了溶菌酶法，反复冻融，超声波破碎法等方法，对其进行列表（表1）比较，可根据其实际情况选择适当的处理方法。

表1 PC粗提取细胞破碎处理方法比较

2 螺旋藻藻蓝蛋白的纯化技术

2.1 传统方法纯化藻蓝蛋白

传统的分离技术纯化藻蓝蛋白如离心、硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、羟基磷灰石层析等［10］。林红卫等［11］在硅藻土545柱上分级洗脱，进一步经 DEAE-纤维素柱纯化，其纯度达到了4.1。另有殷钢等［12］为发展新型海洋药物，采用Sephacryl S-200凝胶层析和羟基磷灰石柱层析对人工养殖钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白进行分离和纯化，得到了藻蓝蛋白纯品。随之韦萍［13］采用自制羟基磷灰石二次上柱可得试剂级的藻蓝蛋白，一次上柱后PC纯度为2.80，二次上柱后纯度为4.18。其次，许宝青［14］采用DEAE-SepharoseFastFlow结合羟基磷灰石柱层析法分离纯化人工养殖钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白，经脱盐、冷冻干燥后得到具有经济价值的藻蓝蛋白纯品纯度为7.25。李冰等［7］把粗蛋白提取液经过两次羟基磷灰石柱（HA）层析和凝胶层析对其纯化，纯度达到4.71。于光等［15］把固体硫酸铵沉淀盐泽螺旋藻藻胆蛋白经羟基磷灰石柱分离纯化具光敏效应的藻蓝蛋白纯度达4.7。邵明飞等［16］在磷酸盐缓冲体系下藻蓝蛋白粗提液经 1.25 mol/L 硫酸铵盐析处理后离心脱气，只需采用一步疏水层析，藻蓝蛋白的纯度可提高到 4.017，回收率为 19.38%。邵明飞等［16］通过六部最佳盐析（25%除杂，55%沉淀）（5%除杂，35%沉淀）（23%除杂，35%沉淀）操作后，藻蓝蛋白纯度为3.61，回收率为47.13%，经过反复盐析（23%除杂，35%沉淀）后，藻蓝蛋白最高纯度达到3.92，回收率为9.66%。这些方法耗时、复杂，难以大规模制备藻蓝蛋白［17］。

2.2 新技术规模化制备藻蓝蛋白

2.2.1 反胶团萃取纯化藻蓝蛋白 反胶团是指非极性溶剂中表面活性剂分子浓度超过临界胶束浓度引发形成的表面活性剂的极性头朝内、非极性头朝外的具有极性内核的多分子聚集体［18］。丁晧［19］等构建了CTAB/正辛烷-正戊醇反胶束体系，通过研究此体系中水合物生成对其中的藻蓝蛋白的萃取作用及纯化效果，获得反胶束水合萃取藻蓝蛋白的动力学规律及温度、压力、CTAB浓度和初始含水量等对反胶束水合萃取藻蓝，研究表明，在初始温度3℃，初始压力4 MPa，CTAB浓度0.10 mol/L，初始含水量40的条件下，水合萃取藻蓝蛋白的萃取率可达81.3%，表明该条件时的萃取效果比较好。反胶束水合萃取完成了萃取、反萃取及纯化过程的有效耦合，相对于加盐反萃取操作难度有所下降，但此方法仍不成熟，有部分藻蓝蛋白流失。另外，刘杨等［20］研究了CTAB/正戊醇-正辛烷反胶团溶液萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白的性能，结果表明，0.04mol/L CTAB/正戊醇-正辛烷（体积比1∶4）的反胶团体系用于萃取pH7.0，包含0.1 mol/L KCl的螺旋藻细胞破碎液，藻蓝蛋白萃取率达96.3%，分配系数打26.0；用pH5.0，包含2 mol/L KBr 的反萃液反萃藻蓝蛋白，反萃取率可达90.6%。

2.2.2 双水相萃取纯化藻蓝蛋白 双水相萃取原理主要是在一定浓度下，两种水溶性不同的聚合物或者一种聚合物和无机盐的混合溶液体系会自然分成互不相容的两相，形成双水相体系，被分离物质进入双水相体系后，在表面性质、电荷间作用和各种作用力等因素的影响下，两相间的分配系数不同，导致上下相的浓度不同而达到分离的目的［21］。刘杨等［22］采用PEG/硫酸钠双水相体系，经一次萃取从钝顶螺旋藻细胞破碎液中富集分离藻蓝蛋白，结果显示，萃取最适宜的条件为12% PEG4000，15% Na2SO4，1% KCl，藻蓝蛋白收率为91.2%，分配系数达到8.01，分离因数达到6.33。随后，王巍杰等［23］对构成双水相体系中不同分子量PEG和酒石酸钾钠浓度的影响进行了分析。 确定了双水相组成体系为 16%的 PEG2000（W/W）和 25%的酒石酸钾钠（W/W），pH值为6.0，在此体系中藻蓝蛋白主要分布在上相，最高纯度3.69，分配系数20.7，回收率94.56%。多次双水相萃取有利于藻蓝蛋白纯度提高，3次双水相萃取后，藻蓝蛋白纯度高达4.15。另外，于淑坤等［24］对聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取螺旋藻藻蓝蛋白进行了研究，结果表明，对于藻蓝蛋白含量为0.282 mg/mL的螺旋藻细胞破碎液，10% PEG2000与20%的硫酸铵双水相体系萃取藻蓝蛋白的效果最佳，经2次萃取，藻蓝蛋白总萃取率为96.1，藻蓝蛋白纯度达到1.2。其次，齐清华［25］采用14% MgSO4、6% PEG2000、0.5% KC1的双水相体系萃取后收集上相，再采用12% PEG、6% MgSO4的双水相体系对藻蓝蛋白进行反萃取，藻蓝蛋白回收率达92.66%，藻蓝蛋白纯度由1.42提高到2.64。可知，双水相萃取法具有节省操作时间、简化操作过程、降低能耗和成本及易于工艺放大等优点。

2.2.3 膨胀床吸附纯化藻蓝蛋白 膨胀床吸附色谱技术是一种介于固定床吸附和流化床之间的一种新型的吸附色谱技术，可以作为实现藻蓝蛋白规模化分离纯化的较好选择［5］。郭静［26］通过自制的膨胀床对螺旋藻藻蓝蛋白的粗提液进行分离富集，藻蓝蛋白的纯度可由粗提液的0.23 最高提高至2.02，藻蓝蛋白浓度从粗提液的0.17 mg/mL 提高为 2.15 mg/ mL，膨胀床分离富集藻蓝蛋白的回收率为 59.45%。然后，在ADS-7 固定床上对膨胀床纯化样品进行层析去除杂蛋白。在优化的条件下，获得的藻蓝蛋白层析样品的藻蓝蛋白纯度为 2.20，藻蓝蛋白浓度为 0.87 mg/mL，藻蓝蛋白回收率为58.81%。整个偶联分离纯化过程耗时 7.0 h，藻蓝蛋白总回收率为34.96%。此外，Niu等［17］将通过硫酸铵沉淀后的藻蛋白粗提液通过装有 50 mL苯基-Sepharose 吸附剂的膨胀床，用大体积上样，体积为298-340 mL的藻蛋白粗提液，采用0.5 mol/L硫酸铵进行脱附，收集流出液。结果表明，通过一步膨胀床吸附，藻蓝蛋白的纯化因子从0.69 提高到3.0左右，且分别得到了 29.9-51.0 g 的藻蓝蛋白。

2.2.4 不同技术结合纯化藻蓝蛋白 刘清新等［27］采用盐析和双水相萃取相结合的方法分离纯化螺旋藻中藻蓝蛋白，盐析法采用饱和度35%-75%的硫酸铵沉淀藻蓝蛋白，饱和度10%-30%的硫酸铵去除螺旋藻杂蛋白；双水相萃取法采用8%PEG4000、16%柠檬酸钠和4%氯化钾组成的双水相系统分离纯化盐析后的藻蓝蛋白。结果表明经6步不同饱和度硫酸铵盐析后的藻蓝蛋白纯度为3.1，再经双水相系统分离纯化可使藻蓝蛋白纯度达4.0，此种方法可大幅提高藻蓝蛋白的纯度，为大规模生产提供科学依据。另外，螺旋藻中的藻蓝蛋白由于存在重金属和微囊藻毒素污染风险，使其相关产品的安全性受到考验。胡梁斌等［28］采用双水相萃取和等电点沉淀对藻蓝蛋白进行分离纯化，最终获得的藻蓝蛋白中重金属Cd的质量浓度从2 μg/mL减少到0.002 3μg/mL，藻毒素的质量浓度则都从3.5 μg/mL降到检测限以下，其安全性可以得到保障。此外，廖晓霞等［3］采用壳聚糖亲和沉淀-活性炭吸附-DEAE Sephadex A-25 柱层析三步法分离纯化藻蓝蛋白，可得到高纯度藻蓝蛋白，纯度达4.3，与传统方法相比，具有成本低、耗时短、操作便捷等优点。

以上介绍了近几年适用于规模化制备PC的新方法，这些方法中各有其优缺点（表2），实际应用时应考虑其具体情况，选择适当的方法。

3 结语

在藻蓝蛋白粗提取方面，人们大多采用反复冻融和超声破碎法。纯化则采用两种以上的色谱技术相结合的方法，但其步骤复杂、产率低不适合规模化生产；双水相萃取、反胶团萃、膨胀床吸附等方法适合规模化分离纯化，但也存在其相应的缺点。因此，具有低成本易操作、高提取率高纯度、适合于大规模生产等优点的分离纯化方法将具有广阔的前景。

表2 PC规模化分离纯化技术方法比较

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（责任编辑狄艳红）

Research Progress on the Extraction and Purification of Phycocyanin from Spirulina

FU Li-li NA Ri GUO Jiu-feng JIN Jing
（College of Physical Science and Technology，Inner Mongolia University，Hohhot 010021）

Phycocyanin has been widely used in food， cosmetics， and medicine due to its physiological properties such as anti-oxidant，improving the body’s immunity， anti-cancer， anti-inflammatory and protecting hepatocyte. Its extraction and purification technology has attracted wide attentions. This work lists several extraction and purification technologies of phycocyanin in recent years， and compares the merits and drawbacks of the major methods.

spirulina；phycocyanin；extraction and purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.011

2015-04-09

国家自然科学基金项目（50267014）

付丽丽，女，硕士研究生，研究方向：实验生物物理；E-mail：359654412@qq.com