异氟醚后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

朱家军, 刘金东, 王大亮, 王永万, 徐海龙

(1. 江苏省灌云县人民医院, 江苏 灌云, 222200; 2徐州医科大学, 江苏 徐州, 221002)



异氟醚后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

朱家军1, 刘金东2, 王大亮2, 王永万1, 徐海龙1

(1. 江苏省灌云县人民医院, 江苏 灌云, 222200; 2徐州医科大学, 江苏 徐州, 221002)

目的探讨异氟醚后处理对不同年龄大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。方法将成年健康雄性SD大鼠18只和老年健康雄性SD大鼠18只采用随机数字表法随机分为3组，对照组(C组)、缺血再灌注组(I/R组)、异氟醚后处理组(IsoPP组)。建立Langendorff离体心脏灌注模型，C组持续灌注130 min; I/R组平衡灌注10 min后缺血30 min再灌注90 min; 异氟醚后处理组平衡灌注10 min缺血30 min, 随后用含有1.5%异氟醚的灌注液灌注15 min, 随后再灌注75 min。于平衡灌注末、再灌注30 min和90 min时记录HR、左室舒张末压(LVEDP)、左室发展压(LVDP)、左心室压力上升最大速率(+dp/dtmax)和左心室压力下降最大速率(-dp/dtmax)。灌注结束后，取心尖部心肌组织1 mm3电镜下观察线粒体结构并评分，剩余心脏组织采用TTC染色法测定心肌梗死面积。结果在成年鼠中，与I/R组相比，异氟醚后处理组心肌再灌注后的心功能指标改善，心肌梗死面积减小，线粒体损伤减轻(P<0.05)；在老年鼠中，与I/R组相比，异氟醚后处理组心肌再灌注后的心功能指标、心肌梗死面积以及线粒体损伤程度均无明显改变(P>0.05)。结论异氟醚后处理减轻了成年老鼠的心肌再灌注损伤，而未能减轻老年鼠心肌的再灌注损伤。

心肌缺血再灌注; 异氟醚后处理; 线粒体超微结构

冠状动脉旁路移植手术、心肌梗死溶栓治疗及心肺复苏等均可引起心肌缺血再灌注损伤。老年患者缺血性心血管疾病发生率较高，更易发生心肌缺血再灌注损伤。因而，吸入麻醉药对此类患者心肌缺血再灌注损伤的影响值得关注。目前，动物实验证实，异氟醚后处理可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤[1-2]，发挥心肌保护作用，但关于异氟醚后处理心肌保护作用的研究在老年动物模型上少见报道[3-4]。本研究采用离体心脏灌注模型，观察比较异氟醚后处理对成年大鼠和老年大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物与分组

健康成年雄性SD 大鼠18只，3～4月龄，体质量220～260 g。健康老年雄性SD 大鼠18只, 18～20月龄，体质量450～550 g, 均由济宁市鲁康动物饲料经销中心提供。成年大鼠和老年大鼠各自随机分为3 组(n=6)：对照组(C组)、缺血/再灌注组(I/R组)和异氟烷后处理组(IsoPP组)。

1.2主要试剂和仪器

异氟醚(批号: 217151201, 深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、异氟醚挥发罐(Drager)、K-H 液(mmol/L: NaCl 8, KCl 4.7, KH2PO41.2, MgSO41.2, CaCl22.5, NaHCO325, 葡萄糖11.1, EDTA -2Na 0.125)、2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC; Sigma公司，美国)、压力传感器(成都泰盟科技有限公司)、H-600透射式电子显微镜(日本日立公司)、LK&V超薄切片机(瑞典LKB公司)。

1.3制备离体心脏缺血再灌注模型

参照文献[5]建立Langendorff大鼠离体心脏灌注模型。腹腔注射3%戊巴比妥30 mg/kg麻醉，腹腔注射500 IU/mL肝素抗凝，迅速开胸取出心脏，置入预充氧的冷K-H液中(0 ℃), 修剪主动脉根部组织，游离主动脉，经主动脉逆行插管将心脏悬挂于Langendorff灌注装置上，以K-H液恒压灌注, K-H液以95%O2+5%CO2混合气体饱和并使其温度和PH值分别维持在(37.0±0.5) ℃和(7.40±0.05)。C组持续灌注K-H液130 min; I/R组平衡灌注K-H液10 min, 然后全心缺血30 min, 随后K-H液再灌注90 min; IsoPP组平衡灌注10 min后全心缺血30 min, 然后改用1.5%异氟醚(大鼠1.0MAC)预充的K-H液灌注15 min, 随后K-H液再灌注75 min。

1.4血流动力学记录

心脏左心耳处剪一小口，将连有压力传感器(成都泰盟科技有限公司)的乳胶球囊(直径约3 mm)经左心房、二尖瓣置人左心室内，球囊内注射生理盐水，使平衡期左室舒张末压(LVEDP)维持0～10 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。经Maclab/4s模数转换器连接计算机，连续记录心功能指标。分别于平衡灌注末(T1)、再灌注15 min(T2)、90 min(T3)时记录HR、LVEDP、左室发展压(LVDP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)。

1.5电镜观察线粒体超微结构

各组再灌注末分别取心尖部心肌组织1 mm3, 经戊二醛—四氧化锇固定液双固定，乙醇梯度脱水，环氧丙烷置换，环氧树脂浸透、包埋，做1～2 pm半超薄切片，美兰染色后光学显微镜下定位；超薄切片机进行50～70 nm超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色后，透射式电子显微镜下观察、拍照，电镜下观察。按照Flameng等评分观察线粒体超微结构[6], 每个标本随机挑选5个视野，每个视野随机选4个线粒体(线粒体观察总数为20)进行损伤程度分级。0级：线粒体超微结构正常，颗粒完好；1级：线粒体结构基本正常，轻度肿胀，线粒体嵴和基质超微结构正常，基质颗粒缺失；2级：线粒体中度肿胀，基质颗粒丧失，基质透明，线粒体嵴没有破坏；3级：线粒体严重肿胀，基质颗粒丧失，基质均匀透明，线粒体嵴断裂；4级：线粒体严重肿胀，基质颗粒丧失，线粒体嵴完全断裂，线粒体膜完整性丧失；分别计0～4分。

1.6TTC染色法测定心肌梗死面积

取心尖部心肌组织1 mm3后的剩余心脏组织保存于-80 ℃冰箱中，标本取齐后取出心脏标本，将心脏横切2 mm薄片4～6片，放入1%TTC磷酸盐缓冲液中(pH=7.4), 37℃水浴箱中闭光孵育10 min, 存活心肌呈砖红色，梗死心肌呈灰白色。染色对比明显后拍照, Image J软件计算心肌梗死区面积，心肌梗死面积=(心肌梗死面积之和/总面积之和)×100%。

2　结　果

2.1血流动力学

在成年大鼠中，与C组比较，I/R组和IsoP组在T2、T3时HR、LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低, LVEDP升高(P<0.05); 与I/R组比较, IsoP组T2、T3时HR、LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高, LVEDP降低(P<0.05)，见表1。在老年大鼠中，与C组比较, I/R组和IsoP组在T2、T3时HR、LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低, LVEDP升高(P<0.05); I/R与IsoP组各项数值没有显著差异(P>0.05), 见表2。

表1　成年大鼠各组在T1、T2、T3时间点血流动力学参数的比较

与C组相比, *P<0.05; 与IR组相比, #P<0.05。

表2　老年大鼠各组在T1、T2、T3时间点血流动力学参数的比较

与C组相比, *P<0.05。

2.2梗死面积

在成年大鼠中，与C组相比, I/R组和IsoP组心肌梗死面积百分比增加(P<0.05)；与I/R相比, IsoP组心肌梗死面积百分比减少(P<0.05)。在老年大鼠中，与C组相比, I/R组和IsoP组心肌梗死面积百分比增加(P<0.05); I/R组与IsoP组心肌梗死面积无显著差异(P>0.05)。见表3。

表3　成年大鼠和老年大鼠各组线粒体超微结构评分的比较

成年大鼠中, 与C组相比, *P<0.05, 与IR组相比, #P<0.05; 老年大鼠中, 与C组相比, **P<0.01。

2.3线粒体超微结构电镜评分

在成年鼠中，与C组相比, I/R组 和IsoP组线粒体损伤加重(P<0.05)；与IR组相比, IsoP组线粒体损伤减轻(P<0.05)。 在老年鼠中，与C组相比, I/R组 和IsoP组线粒体损伤加重(P<0.05)；与IR组相比, IsoP组线粒体损伤无明显减轻(P>0.05)。见表3。

3　讨　论

与异氟醚预处理相比，异氟醚后处理在再灌注早期进行，无需对再灌注开始时间进行预测，因而更具有临床意义。与在体缺血再灌注模型相比, Langendorff大鼠离体心脏灌注模型的优点是可以排除神经、内分泌等因素对研究结果产生的影响，实验结果较为客观。本研究结果表明，在成年鼠中，异氟醚后处理可以减轻缺血再灌注后的心功能，减轻线粒体损伤，减小心肌梗死面积，而在老年大鼠中，异氟醚后处理的心肌保护作用不再存在。

线粒体是氧化呼吸、能量生成的重要场所，其结构功能的稳定对维持心肌细胞活性至关重要。缺血再灌注过程可使得线粒体内活性氧物种生成增加[7], 活性氧的大量生成可造成线粒体膜结构的破坏，进而造成心肌细胞的死亡。此外，缺血再灌注时，心肌细胞的缺血、缺氧还会造成线粒体基质钙离子超载[8], 而线粒体钙超载引起线粒体通透性转化孔开放的重要因素。mPTP开放被认为是缺血再灌注损伤产生的关键环节[9]。线粒体通透性转化孔开放会引起线粒体肿胀，进而引起线粒体膜破裂，造成线粒体内细胞色素c释放，启动凋亡信号，引起心肌细胞凋亡，线粒体的损伤也会引起ATP耗竭进而引起心肌细胞坏死[10]。由此可见，心肌线粒体结构的损伤程度与再灌注损伤程度密切相关。因此本实验通过电镜观察线粒体超微结构来判断异氟醚后处理对心肌线粒体的影响。结果表明，异氟醚后处理可以减轻成年大鼠心肌线粒体的再灌注损伤，但不能对老年大鼠心肌线粒体发挥保护作用。本实验的局限之处在于仅观察了线粒体的超微结构，而没有对线粒体的功能进行评估分析，后续试验可进一步分析异氟醚后处理对再灌注后线粒体膜电位、ATP生成量等的影响。

综上所述，本研究表明七氟醚后处理可以减轻成年大鼠心肌缺血再灌注损伤，其机制与增加线粒体对损伤性刺激的抵抗作用有关，而七氟醚后处理未能对老年大鼠发挥心肌保护作用。

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Effect of isoflurane treatment on myocardial ischemia-reperfusion injury of rats

ZHU Jiajun1, LIU Jindong2, WANG Daliang2, WANG Yongwan1, XU Hailong1

(1.GuanyunCountyPeople′sHospitalofJiangsuProvince,Guanyun,Jiangsu, 222200;2.XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou,Jiangsu, 221002 )

ObjectiveTo investigate the isoflurane treatment for myocardial ischemia reperfusion injury of rats at different ages. MethodsA total of 18 healthy male SD rats and 18 healthy male SD rats were randomly divided into control group (group C), ischemia-reperfusion (I/R group), isoflurane after treatment group (IsoPP group). Langendorff isolated heart perfusion model was established, group C was infused for 130 min, I/R group was re-perfused for 10 min and after ischemia for 30 min, reperfusion was carried out for 90 min. Isoflurane treated group was re-perfused for 10 min and in ischemia for 30min, followed by containing 1.5% isoflurane perfusion for 15 min, and reperfusion for 75 min. At the end of balance perfusion, HR, left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP), left ventricular developed pressure (LVDP), left ventricular maximum rate of pressure rise (+dp/dtmax) and left ventricular maximum rate of pressure drop (-dp/dtmax) were recorded after reperfusion for 30 min and 90 min. At the end of infusion, apical myocardial tissue 1 mm3mitochondrial structure was observed by electron microscopy, infarct size was measured using the remaining heart tissue TTC staining. ResultsIn adult mice, compared with I/R group, cardiac function indexes after sevoflurane treatment were improved after myocardial reperfusion, infarct size of mitochondrial damage mitigation was decreased (P<0.05); In older mice, compared with I/R group, the cardiac function after isoflurane myocardial reperfusion, the area and the degree of mitochondrial damage of myocardial infarction in isoflurane after treatment group were not significantly changed (P>0.05). ConclusionIsoflurane after treatment can reduce myocardial reperfusion injury, and failure to reduce reperfusion injury of myocardium in aged rats.

myocardial ischemia and reperfusion; isoflurane aftertreatment; ultrastructural structure of mitochondria

2015-12-16

江苏省连云港市第五期“521工程”科研项目资助计划(2014-62)

刘金东

R 542.2

A

1672-2353(2016)17-004-04

10.7619/jcmp.201617002