二甲双胍联合compound C对小鼠4T1乳腺癌细胞增殖和细胞周期蛋白D1表达的影响

马宇光, 张寅斌, 梁　亮, 赵　阳, 焦菊凤, 昝　瑛

(西安交通大学第二附属医院 肿瘤科, 陕西 西安, 710000)



论著

二甲双胍联合compound C对小鼠4T1乳腺癌细胞增殖和细胞周期蛋白D1表达的影响

马宇光, 张寅斌, 梁亮, 赵阳, 焦菊凤, 昝瑛

(西安交通大学第二附属医院 肿瘤科, 陕西 西安, 710000)

目的探讨二甲双胍及单磷酸腺苷活化蛋白激酶抑制剂(compound C)对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达的影响。方法选取小鼠乳腺癌4T1细胞体外培养，分别以完全培养基为空白组, 4T1细胞为对照组，在细胞培养中分别加入浓度为2.5、5、10、20、40 mmol/L的二甲双胍为实验组1～5, 以10 mmol/L的二甲双胍联合20 μmol/L compound C的为实验组6, 20 μmol/L compound C的为实验组7。检测各组细胞株增殖情况及细胞内cyclin D1的表达。结果 二甲双胍作用24、48 h时，实验组1与对照组存活率无显著差异(P>0.05), 实验组2～5细胞存活率显著低于对照组(P<0.05); 72 h时，实验组1～5存活率均显著低于对照组(P<0.05); 实验组3、4、5在24、48、72 h时，各组cyclin D1的相对表达量均显著低于对照组(P<0.05); 各组48 h时cyclin D1的相对表达量显著低于24 h时(P<0.05); 72 h时cyclin D1的相对表达量显著低于各组48 h时(P<0.05); 实验组3 cyclin D1的相对表达量显著低于对照组(P<0.05), 实验组6、7在各时间点与对照组比较无显著差异(P>0.05)。结论二甲双胍能抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖，而compound C对其有拮抗作用；二甲双胍对小鼠乳腺癌4T1细胞cyclin D1蛋白表达有下调作用。

乳腺癌; 4T1细胞; 二甲双胍; compound C; 细胞增殖; 细胞周期蛋白D1

全球乳腺癌发病率一直呈上升趋势，中国不是乳腺癌的高发国家，但近年来发病率的增长速度高出高发国1～2%左右[1]。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局公布的乳腺癌发病数据，全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率城市为34.3/10万，农村为17.0/10万[2]。乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，乳腺癌细胞之间黏连松散、容易脱落，导致癌细胞游离，随血液或淋巴系统而扩散、转移，危及生命[3]。二甲双胍最早作为胰岛素增敏剂用于治疗2型糖尿病，近年来研究发现其可以抑制肿瘤生长、降低恶性肿瘤发病风险[4]。本研究从细胞层面入手，检测了二甲双胍及单磷酸腺苷活化蛋白激酶抑制剂(compound C)对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达的影响，为动物实验及临床研究提供一定依据。

1　材料与方法

1.1药品与试剂

小鼠乳腺癌4T1细胞购于中国科学院上海细胞库; RPMI-1640培养基、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、盐酸二甲双胍、cyclin D1抗体、compound C干粉、胰蛋白酶、CCK-8试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)、放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解液、电化学(ECL)发光液均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2实验方法

常规细胞复苏、培养，传代3次后取对数生长期细胞，接种于96孔板中，密度为1×103/孔，每组6孔。实验共8组。空白组：完全培养基，对照组：未经处理的4T1细胞；实验组1～5: 在细胞培养基中分别加入浓度为2.5、5、10、20、40 mmol/L的二甲双胍；实验组6：加10 mmol/L的二甲双胍联合20 μmol/L compound C(compound C给药24 h后加入二甲双胍)；实验组7：加20 μmol/L compound C。实验重复3次。

1.3检测方法

1.3.1CCK-8检测细胞增殖能力：分别于加药24、48、72 h后取出，各孔加CCK-8溶液10 μL, 于培养箱内继续培养1 h后进行检测，酶标仪450 nm波长处测定各组吸光度值，重复3次。存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.3.2Western Blot检测细胞周期蛋白D1表达量：细胞收集后提取总蛋白，测定蛋白浓度，调整各样品蛋白浓度至相当，按一定比例(蛋白样品体积：蛋白上样缓冲液体积为4: 1)加入蛋白上样缓冲液, 100 ℃加热样品使蛋白变性5 min, 离心20 s, 冷却后置于-20 ℃备用。每孔加入1 μL的蛋白样品，同时加入10 μL彩色预染蛋白分子量标准Marker, 进行SDS-PAGE电泳，于60 V电压恒定跑胶30 min, 调电压至80 V, 稳压电泳90 min, 待条带接近底部边缘时终止。转膜完成后取适量丽春红染液中染色5 min, 洗去浮色，判断蛋白转移情况。采用TBST缓冲液清洗后加5%的脱脂奶粉封闭1～2 h, 随后TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min; 洗完膜后孵育一抗和二抗，最后采用ECL发光试剂盒，完成X片曝光、显影及定影, Western Blot均在相同条件下重复3次。Cyclin D1的相对定量=Cyclin D1蛋白条带的灰度值/β-actin蛋白条带的灰度值。

1.4统计学方法

2　结　果

2.1二甲双胍及compound C对小鼠乳腺癌4T1细胞存活率的影响

二甲双胍作用24、48 h时，实验组1与对照组细胞存活率无显著差异(P>0.05), 实验组2～5细胞存活率显著低于对照组(P<0.05); 72 h时，实验组1～5细胞存活率均显著低于对照组(P<0.05)。见表1。

2.2二甲双胍联合compound C对小鼠乳腺癌4T1细胞存活率的影响

由于实验组3在24、48及72 h时细胞存活率均在50%左右，故后续实验选用10 mmol/L的浓度与compound C联合作用。实验组3在24、48、72 h时细胞存活率均低于对照组(P<0.05), 实验组6、7在24、48、72 h时细胞存活率与对照组比较均无显著差异(P>0.05)。见表2。

表1　不同浓度二甲双胍作用不同时间后各组小鼠乳腺癌 4T1细胞的存活率比较

与对照组比较, *P<0.05; 与24 h比较, #P<0.05。

表2　二甲双胍联合compound C对小鼠乳腺癌4T1细胞 的存活率比较±s)

与对照组比较, *P<0.05。

2.3二甲双胍及compound C对小鼠4T1细胞周期蛋白D1的表达影响

实验组2、3、4在24、48、72 h时cyclin D1的相对表达量均显著低于对照组(P<0.05); 各组2、3、4在48 h时cyclin D1的相对表达量显著低于24 h时(P<0.05); 实验组2、3、4在72 h时cyclin D1的相对表达量显著低于各组48 h时(P<0.05)。见表3。

表3　不同浓度二甲双胍处理细胞后cyclin D1的 表达情况

与对照组比较, *P<0.05; 与24 h比较, #P<0.05;

与48 h比较, △P<0.05。

2.4二甲双胍联合compound C处理细胞后cyclin D1的表达情况

实验组3 cyclin D1的相对表达量显著低于对照组(P<0.05); 实验组6、7在各时间点与对照组比较无显著差异(P>0.05)。见表4。

表4　二甲双胍联合compound C处理细胞后cyclin D1 的表达情况

与对照组比较, *P<0.05。

3　讨　论

二甲双胍对肿瘤细胞增殖间接抑制作用主要通过减少循环中的胰岛素水平，通过影响胰岛素和胰岛素样生长因子-1通路间接抑制肿瘤细胞的增殖[5]; 二甲双胍通过激活单磷酸腺苷依赖蛋白激酶(AMPK)通路来实现对肿瘤细胞增殖的直接抑制作用[6], 降低微管蛋白、组蛋白等细胞分裂相关基因的表达，从而抑制细胞的分裂和增殖[7-8]; 另外，二甲双胍还能提高T细胞记忆力，当免疫系统遭到病毒感染或癌细胞攻击的时候能增强反应力度，降低恶性肿瘤的发生率[9]。恶性肿瘤细胞无限增殖主要是由于细胞周期调节失控，而细胞分裂周期的关键在于G1/S、G2/M期之间的转换[10]。细胞G1期调控的关键因素为cyclin D1, 而当cyclin D1过表达时，可缩短细胞G1期，提前进入S期，使细胞增生异常[11-12], 因此cyclin D1低表达者的生存率高于cyclin D1过表达者，而AMPK通过使cyclin D1 mRNA丢失从而使其蛋白表达量下调，从而抑制细胞增殖。

本研究从细胞层面着手，应用不同浓度二甲双胍对小鼠乳腺癌4T1细胞进行体外培养，分别于24、48、72 h时经CCK-8法测定细胞存活率，结果显示随着二甲双胍浓度的增加和作用时间的延长，对细胞增殖的抑制更明显，二甲双胍对乳腺癌细胞的增殖抑制作用表现出了良好的浓度依赖性且与时间也呈较好的依赖性。单用compound C时，细胞存活率与正常对照组无显著差异，提示compound C对细胞增殖无抑制作用；而二甲双胍与compound C联合使用时，其存活率与对照组也无统计学差异，提示compound C与二甲双胍有拮抗作用，与杜洪泉等[13]研究结果一致。

Western bolt实验结果显示，随二甲双胍浓度增加, cyclin D1表达量明显下调，从而抑制细胞增殖，与CCK-8检测结果吻合，提示二甲双胍对

4T1细胞的增殖有抑制作用；而compound C作为AMPK抑制剂，在与二甲双胍联合应用时, cyclin D1表达量与对照组无显著差异，提示其阻碍了二甲双胍激活AMPK通路，与Cai等[14]研究结果一致。

本研究表明二甲双胍对小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖有抑制作用，而其作用机制可能是通过激活AMPK通路，下调cyclin D1表达量来实现的。

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Influence of metformin combined with compound C on the proliferation of breast cancer 4T1 cells and expression of cyclin D1 in mice

MA Yuguang, ZHANG Yinbin, LIANG Liang, ZHAO Yang, JIAO Jufeng, ZAN Ying

(DepartmentofOncology,TheSecondAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi, 710000)

ObjectiveTo investigate the influence of metformin combined with adenosine monophosphate-activated protein kinase inhibitors (compound C) on the proliferation of breast cancer 4T1 cells and expression of cyclin D1 in mice. MethodsBreast cancer 4T1 cells were selected and cultured in vitro. The complete medium was considered as blank group, 4T1 cells as control group, addition of metformin 2.5, 5, 10, 20 and 40 mmol/L to the cell culture respectively as experimental groups 1～5, metformin (10 mmol/L) combined with compound C (20 μmol/L) as experimental group 6, and compound C 20 μmol/L as experimental group 7. The proliferation of cell lines and expression of intracellular cyclin D1 were respectively detected in each group. ResultsWhen metformin functioned for 24 and 48 h, no significant difference was shown between experimental group 1 and control group regarding the survival rate (P>0.05), but the cell survival rates of experimental groups 2～5 were significantly lower than those of control group (P<0.05). At the time of 72 h, the survival rates of experimental groups 1～5 were all markedly lower than those of control group (P<0.05). At the time of 24, 48 and 72 h, the relative expression quantities of cyclin D1 in experimental groups 1～3 were all significantly lower than those in control group (P<0.05). In each group, the relative expression quantity of cyclin D1 was lower at 48 h than at 24 h (P<0.05), and that was also lower at 72 h than at 48 h (P<0.05). Additionally, the relative expression quantity of cyclin D1 was significantly lower in experimental group 3 than in control group (P<0.05), but nosignificant difference was shown by comparing experimental groups 6 and 7 with control group at each time points (P>0.05). ConclusionMetformin can inhibit the proliferation of breast cancer 4T1 cells in mice,but this effect can be resisted by compound C. Metformin can down-regulate cyclin D1 expression of breast cancer 4T1 cells in mice.

breast cancer; 4T1 cells; metformin; compound C; cell proliferation; cyclin D1

2016-03-23

R 737.9

A

1672-2353(2016)17-001-03

10.7619/jcmp.201617001