鼻黏膜外胚层间充质干细胞诱导分化成骨细胞的实验分析

孙海宁　雷海锋　王振清　赵咏梅陕西省铜川矿务局中心医院耳鼻喉科，陕西铜川　727000

鼻黏膜外胚层间充质干细胞诱导分化成骨细胞的实验分析

孙海宁雷海锋王振清赵咏梅
陕西省铜川矿务局中心医院耳鼻喉科，陕西铜川727000

目的 探讨鼻黏膜外胚层间充质干细胞经诱导分化为成骨细胞的效果。方法 收集SD大鼠鼻黏膜，进行鼻黏膜外胚层间充质干细胞体外培养。对细胞表面标志物CD45-FITC、CD14-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD71-PE、CD34-PE、CD44-PE进行鉴定，并对细胞进行成骨诱导。成骨诱导分化后检测细胞在不同时间的碱性磷酸酶活性变化情况，并对细胞进行茜素红染色，观察细胞诱导分化效果。结果大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞经成骨诱导分化后，碱性磷酸酶活性在诱导4 d后显著增加，并在7 d达到最大值，之后逐渐下降。成骨诱导至21 d，对大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞进行茜素红染色之后可观察到结果呈现出阳性，细胞外基质中出现钙沉积以及钙结节形成。结论 在大鼠鼻黏膜中存在一定的外胚层间充质干细胞，该细胞具有分化潜能，经诱导分化可分化为成骨细胞，具有一定的临床应用前景。

外胚层间充质干细胞；鼻黏膜；诱导；分化；成骨细胞

［Abstract］Objective To investigate the effect of the induction and differentiation of ectomesenchymal stem cells derived from nasal mucosa into osteoblast.Methods The nasal mucosa of SD rat was collected and the ectomesenchymal stem cells derived from nasal mucosa were cultured in vitro.The cell surface markers CD45-FITC，CD14-PE，CD105-PE，CD34-PE，CD71-PE，CD34-PE，CD44-PE were identified，and the cells were taken osteogenic induction.After induction and differentiation of osteoblast，the changes of alkaline phosphatase activities in different time were detected，and the cells were taken alizarin red staining，the effects of induction and differentiation of cells were observed. Results Through induction and differentiation of osteoblast，the alkaline phosphatase activities of ectomesenchymal stem cells derived from nasal mucosa were increased significantly after induction for 4 d，which reached maximum value at 7 d and decreased gradually later.After osteogenic induction for 21 d，the ectomesenchymal stem cells derived from nasal mucosa by alizarin red staining showed positive results，extracellular matrix showed calcium deposit and the formation of calcium nodule.Conclusion There are some ectomesenchymal stem cells′in the nasal mucosa of rats，the cells have the ability of differentiation and can be differentiated into osteoblasts through induction and differentiation，which has certain clinical application prospects.

［Key words］Ectomesenchymal stem cells；Nasal mucosa；Induction；Differentiation；Osteoblast

干细胞具有自我更新和自我分化能力，可以在一定的条件下分化为多种不同类型的细胞，应用于临床各种疾病的治疗之中［1］。外胚层来源的间充质干细胞是一种重要的干细胞类型，在一定的体外条件下也可以发生分化［2-3］。分化的细胞可以有多种类型，包括成骨细胞和脂肪细胞以及神经细胞等。其中，成骨细胞在临床的应用十分广泛。外胚层间充质干细胞主要存在于头面部黏膜固有层中，其中，鼻黏膜是一个重要的细胞来源，可以分化为不同的细胞［4］。但是，关于鼻黏膜来源的外胚层间充质干细胞向成骨细胞的定向诱导及分化问题，相关的研究和报道较少。本研究探讨鼻黏膜外胚层间充质干细胞经诱导分化为成骨细胞的效果，以期为临床治疗提供一定的实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

纳入SD大鼠5只，体重300 g左右，均为雄性，健康状况良好。实验动物均由济南市金丰实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK（鲁）2014-0006。本研究相关方案均提交医院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。

1.2方法

1.2.1大鼠鼻黏膜收集［5］对SD大鼠进行戊巴比妥钠麻醉，达到麻醉效果之后处死。在超净工作台上剪下大鼠鼻道末端，收集1/3鼻中隔组织。将组织置于玻璃培养皿中，利用PBS进行3次洗涤，并对鼻中隔表面呼吸黏膜进行分离。

1.2.2大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞培养［6］对上述步骤采集到的呼吸黏膜进行处理，利用眼科剪剪为小碎块，添加胰蛋白酶进行消化。置于37℃恒温箱中消化5 min后取出，添加含有胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化。终止消化后进行离心，去掉上清，对细胞进行重悬，以1×106个/mL的浓度将细胞接种在培养瓶中，将培养瓶置入二氧化碳培养箱中进行常规原代和传代培养。

1.2.3细胞免疫表型鉴定［7-8］倒置显微镜下观察细胞生长情况，收集生长状态良好的P3细胞，分别用PE或FITC偶联的CD45-FITC、CD14-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD71-PE、CD34-PE、CD44-PE对细胞进行标记，上流式细胞仪进行细胞免疫表型检测。

1.2.4大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞增殖情况检测［9］利用MTT法对细胞的增殖情况进行检测，收集P3细胞，胰蛋白酶消化之后制备细胞悬液，接种在96孔板中，添加完全培养基置于二氧化碳培养箱中进行培养。从接种后第1天起，每天取1板细胞，利用MTT法检对细胞增殖情况进行检测，使用酶联免疫检测仪检测各孔的光吸收值（OD值），连续监测7 d。完成记录数据，并利用数据描绘出细胞的体外增殖曲线。

1.2.5大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨诱导分化［10］间充质干细胞传至第3代，胰酶消化传代，接种于6孔板，进行成骨诱导培养，诱导培养基含有β-甘油磷酸钠和维生素C以及地塞米松，每3天更换1次培养基。

1.2.6大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨诱导碱性磷酸酶的活性定量检测［11］收集诱导后间充质干细胞，胰酶消化，接种在培养板上。观察细胞融合情况，待达到100%之后利用对硝基苯棕榈酸酯法对碱性磷酸酶的活性进行定量检测，连续10 d，利用试剂盒进行检测，记录检测结果。

1.2.7大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨诱导分化细胞中钙结节的形成检测［12］大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨诱导21 d后，去除培养液，PBS洗涤之后利用乙醇进行固定，去离子水轻柔冲洗后添加茜素红染色液进行孵育。孵育结束吸除多余染色液，去离子水漂洗、振荡，最后置于镜下观察、拍照。

1.3观察指标

观察细胞培养形态和表面标志物鉴定结果，并对成骨诱导分化后细胞在不同时间的碱性磷酸酶活性变化情况进行检测。对细胞进行茜素红染色，观察细胞诱导分化效果。

2　结果

2.1实验流程

实验流程见图1。

图1　实验流程

2.2大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞培养结果

接种后1 d，细胞开始发生贴壁，大多数细胞呈梭形或椭圆形（图2A）。培养7 d，细胞大部分融合（图2B）。传经代培养，细胞大多呈梭形或椭圆形，且呈现出较为一致的排列方向（图2C）。

2.3大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞鉴定结果

利用流式细胞仪对大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞表面抗原进行检测，可得CD45、CD14、CD34、CD71均呈阴性表达，CD133、CD105、CD44均呈阳性表达。见表1。

表1　流式细胞仪检测大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞表面抗原结果（%，x±s）

图2　大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞培养结果（100×）

2.4大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞体外增殖曲线

MTT法检测大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞不同时间OD值，描绘细胞增殖曲线，可得基本呈“S”型，1～3 d曲线平稳上升，细胞缓慢增殖，4 d开始曲线变得陡峭，细胞增殖速度明显加快，之后持续上升，并于7 d开始下降。见图3。

图3　大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞体外增殖曲线

2.5大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶表达水平

大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶活性在诱导4 d后显著增加，并在7 d达到最大值，之后逐渐下降。见图4。

图4　细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶表达水平变化情况

2.6大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨诱导分化后钙结节染色情况

成骨诱导至21 d，对大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞进行茜素红染色之后可观察到结果呈现出阳性，细胞外基质中出现钙沉积以及钙结节形成。见图5。

图5　大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨诱导分化后钙结节染色情况（茜素红，200×）

3　讨论

间充质干细胞具有很强的多向分化潜能和自我增殖能力，可以在一定条件下发生分化。赵红斌等［13］报道，间充质干细胞可以向成骨细胞发生分化，且分化过程受到多种因素的影响，机械力可以通过Ca2+信号、细胞微丝结构以及PI3Ks信号途径导致一定应答反应和生物学效应的出现，进而影响到细胞的成骨分化。间充质干细胞具有不同的类型，不同的细胞类型均有可能分化为成骨细胞。鞠晓东等［14］收集3周龄Lewis大鼠腹股沟脂肪垫进行培养，成功获得脂肪间充质干细胞，并通过成骨诱导培养基培养，诱导细胞向成骨细胞方向发生分化。

外胚层间充质干细胞主要存在于头面部黏膜固有层中，具有一定的分化潜能，在一定的条件下可定向分化为不同的细胞类型，包括神经细胞和成骨细胞以及脂肪细胞等，具有较高的临床应用价值。以往王亦菁等［15］通过研究报道，牙髓干细胞、外胚间充质干细胞的细胞形态均与骨髓间充质干细胞十分相似，外胚间充质干细胞增殖能力较强，包含多种间充质类型细胞，有望成为临床口腔颌面部间充质干细胞的重要来源。在鼻中隔黏膜组织中，大的部分均属于呼吸黏膜，呼吸黏膜均起源于外胚层。在鼻黏膜中，可以获得一定的干细胞，相应的干细胞可以在一定条件下分化为不同的细胞类型。张健等［16］收集大鼠鼻甲组织，经分离、培养获得鼻黏膜来源干细胞，并利用成纤维细胞生长因子对细胞进行诱导，使之成功分化为施万样细胞。

本研究从SD大鼠鼻中隔收集呼吸黏膜，并通过体外培养，获得实验所需的外胚层间充质干细胞。对间充质干细胞进行鉴定的时候，常用的标志物包括CD133、CD105、CD44等。本研究结果显示，利用流式细胞仪对大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞表面抗原进行检测，CD133、CD105、CD44均呈阳性表达，提示相应的细胞为外胚层间充质干细胞。间充质干细胞具有很强的多项分化潜能，实际应用过程中，可以按照实际需要，对细胞进行一定的定向诱导，促进其向一定的方向发生分化，获得所需细胞类型。在对鼻黏膜外胚层间充质干细胞进行成骨诱导的时候，本研究参考以往学者的方法［17］，制备所需的诱导培养基。培养基中含有多种成分，包括β-甘油磷酸钠和维生素C以及地塞米松。其中，地塞米松可以对细胞各项活动予以有效的调节，维生素C可以参与到Ⅰ型胶原的早期合成环节之中，β-甘油磷酸钠可以参与到细胞外基质的矿化过程中［18］。在观察细胞成骨效果的过程中，可以选择对一定的指标进行观察。碱性磷酸酶是成骨细胞的一种重要组成成分，可以对参与骨代谢重要蛋白以及成骨细胞分化相关情况予以反映［19］。本研究结果显示，大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞经成骨诱导分化后碱性磷酸酶活性在诱导4 d呈现出显著增加的情况，并在7 d达到最大值，之后逐渐下降。即提示，在经过一定的成骨诱导之后，细胞向成骨细胞方向进行分化。另外，成骨细胞可以分泌碱性磷酸酶，导致磷酸局部水平的上升。碱性磷酸酶在细胞外基质中的大量分泌会对细胞外基质矿化过程产生积极的促进作用，使得钙盐大量沉积［20］。本研究发现，成骨诱导至21 d，对大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞进行茜素红染色之后可观察到结果呈现出阳性，细胞外基质中出现钙沉积以及钙结节形成。这一结果也进一步证明，在经过一定的成骨诱导之后，鼠鼻黏膜间充质干细胞向成骨细胞分化。

综上所述，通过本研究初步提示，在大鼠鼻黏膜中存在一定的外胚层间充质干细胞，该细胞具有分化潜能，可以经诱导分化为成骨细胞。另外，鼻黏膜取材方面，可以为临床细胞培养提供丰富的材料来源。为此，鼻黏膜来源的外胚层间充质干细胞具有一定的临床应用前景，关于其临床应用效果，还有待在今后予以进一步的分析。

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Experimental analysis of the induction and differentiation of ectomesenchymal stem cells derived from nasal mucosa into osteoblast

SUN HainingLEI HaifengWANG ZhenqingZHAO Yongmei
Department of Ear-Nose-Throat，Central Hospital of Tongchuan Mining Bureau of Shaanxi Province，Shaanxi Province，Tongchuan727000，China

R329.2

A

1674-4721（2016）08（b）-0029-05

2016-04-03本文编辑：张瑜杰）