草莓皱缩病毒（SCV）外壳蛋白抗原表位的预测、编码片段的克隆及表达

李云春 杨菊梅 马建忠** 王永刚 魏艳 吕贵雪（兰州理工大学生命科学与工程学院）本研究工作受甘肃启明星节能科技有限公司和国家大学生创新创业训练项目的资助



草莓皱缩病毒（SCV）外壳蛋白抗原表位的预测、编码片段的克隆及表达

李云春 杨菊梅 马建忠** 王永刚 魏艳 吕贵雪
（兰州理工大学生命科学与工程学院）
本研究工作受甘肃启明星节能科技有限公司和国家大学生创新创业训练项目的资助

应用生物信息学软件DNAStar、DNAMAN及Bepipred线性表位预测（http：//tools.immunee pitope.org/tools/bcell/ iedb-input）在线工具对草莓皱缩病毒（Strawberry Crinkle Virus， SCV） 78kDa外壳蛋白的氨基酸序列进行了分析，选择了一段抗原表位预测较强的27氨基酸残基的区段（S3）。依据大肠杆菌的密码子偏好性化学合成了编码S3区段的DNA片段并克隆至大肠杆菌表达载体pET32a（+）中，序列分析确定了含正确插入片段的重组质粒pET32a（+）-S3。转化上述重组质粒至大肠杆菌菌株BL21（DE3）中并诱导重组蛋白表达。表达产物经SDS-PAGE分析表明，受IPTG诱导表达的重组蛋白与所构建的重组蛋白的分子量一致。

草莓皱缩病毒；抗原表位预测；基因克隆；基因表达

草莓（Fragaria spp.）是蔷薇科草莓属多年生草本植物，也是一种广受欢迎的水果类经济作物。随着栽培面积的不断扩大，病毒对其危害日益严重。在我国草莓种植区，草莓皱缩病毒（Strawberry Crinkle Virus， SCV）是造成草莓产量严重损失的主要病毒之一。SCV属于弹状病毒科、细胞质弹状病毒属［1］。SCV的基因组长14547个核苷酸残基，有7个开放阅读框，编码4个蛋白质，其外壳蛋白（Coat Protein，CP）由3个结构蛋白组成，其大小分别为 78、47、25kDa［2］。利用DNAMAN和DNAStar等多个生物信息学软件、综合分析SCV的78kDa外壳蛋白氨基酸残基序列，确定了一段抗原表位较强的区段S3，实现了S3编码区段DNA的克隆和大肠杆菌诱导表达。

1 、材料与方法

1.1 实验材料

质粒pET32a（+），大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α和菌株BL21（DE3）为本实验室所保存。

1.2 DNA合成及表达载体的构建

依据大肠杆菌的密码子偏好性，设计了S3区段的DNA编码序列并委托上海生工生物工程有限公司化学合成，合成后的片段插入pET32a（+）表达载体的XhoI位点［3］。

1.3 pET32a（+）-S3的转化及其表达分析

序列分析正确的重组质粒pET32a（+）-S3转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株并诱导表达［3］。表达产物用SDS-PAGE分析［3］。

2 、结果

图1 预测出的抗原表位较强的区段S3及合成的DNA编码序列

应用DNAMAN、DNAStar及在线预测工具Bepipred（http：//tools.immune epitope.org/tools/bcell/iedb-input） 等生物信息学软件，对SCV的78kDa的外壳蛋白的抗原表位进行了预测，抗原表位较强的区段S3及其编码序列如图1所示。DNA编码序列合成后插入了表达载体pET32a（+）。重组质粒pET32a（+）-S3在大肠杆菌中的表达结果如图2所示。经0.5mM IPTG诱导后，在24.0kDa附近出现了一条诱导蛋白带，这一诱导表达蛋白的分子量与预期的重组蛋白一致。随着诱导时间的增加，目的蛋白表达量也增加。BandScan分析表明，诱导4h后该蛋白条带可占到总蛋白的57.9%。

图2 表达蛋白的SDS-PAGE分析（M泳道为低分子量蛋白质标志，1号泳道为诱导前菌体总蛋白条带，2-5号泳道分别为0.5mM IPTG诱导1、2、4、6h的总蛋白条带，上样量为10μl，箭头所指为诱导表达蛋白条带）

3 、结论

在本文中，对SCV的78kDa外壳蛋白的抗原表位进行了预测，合成了编码该抗原表位的DNA片段，克隆并实现了表达，获得了与预期分子量一致的诱导表达蛋白条带。

［1］ Leone， G， Lindner， J. L， Schoen， C， D. Attempts to purify strawberry virus by non-conventional separation methods， 1992.

［2］ Khrks， M. M， Lindner， J. L， Vaskova， D. Detection and tentative grouping of Strawberry crinkle virus isolates. European Journal of Plant pathology. 2004， 110： 45-52.

［3］ J. 萨姆布鲁克， D. W. 拉塞尔 著， 黄培堂等 译. 分子克隆实验指南［M］. 科学出版社， 第三版.