低血清培养的BHK21细胞染色体遗传稳定性分析

陈苗苗， 董金杰， 杜 平

(中农威特生物科技股份有限公司， 甘肃兰州 730046)



低血清培养的BHK21细胞染色体遗传稳定性分析

陈苗苗， 董金杰， 杜 平

(中农威特生物科技股份有限公司， 甘肃兰州 730046)

[目的]对一种商业化的低血清培养基适应BHK21细胞进行传代培养，并分析该细胞染色体的变异稳定性，以判定其质量。[方法]采用直接法制备4个代次BHK21细胞的染色体标本，用常规Giemsa染色，在1 000倍光学显微镜下计数中期分裂相染色体数目，并进行核型分析。[结果]BHK21为亚二倍体或亚四倍体细胞系，亚二倍体总数为42，亚四倍体细胞总数为72～74，该细胞系染色体的畸变率在各代次所占比例为0～2%，均较低。[结论]该细胞系的遗传学特性相对稳定，各代次间无本质差异，可候选为制苗用细胞。

低血清；BHK21；染色体；遗传稳定性

BHK21细胞对口蹄疫病毒敏感，且又是口蹄疫病毒很好的宿主细胞，在口蹄疫疫苗生产中，均使用BHK21细胞对口蹄疫病毒进行繁殖。无论是传统的转瓶工艺还是悬浮培养工艺，都以贴壁的BHK21细胞为驯化对象，由权威机构ATCC保存的BHK21细胞，此传代细胞遗传上具有一定的变异性。为了保证口蹄疫病毒生产的高效性，保证宿主细胞的遗传稳定性则是重中之重。目前检测细胞变异系数的有效方法是核型分析，这是细胞遗传学及细胞生物学的核心技术之一。该技术可用于研究细胞和组织及个体的特异性鉴定、遗传变异和种属进化关系。

目前，医院常采用外周血、骨髓、羊水制备染色体诊断染色体上的疾病[1-2]。关于传代细胞的核型分析技术研究很少。传代细胞具有驯化成熟、人为控制性强的特点，在实际科研、检验、疫苗生产以及生物制品研发等领域被广泛应用。笔者以低血清培养适应的BHK21细胞进行传代培养，染色体标本制备参考翁炳焕等[3]提出的考评标准，其中，可分析分裂相的要求为数目明确、全部染色体集中但不重叠、染色体伸展适度、着丝粒清晰、染色清晰[4]，取4个代次400个中期分裂相的染色体进行分析，判定该细胞系的畸变率，以此为依据筛选优良的细胞株。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂。秋水仙素;卡诺氏固定液，甲醇∶冰醋酸=3∶1；吉姆萨染色液；25 g/L胰蛋白；胎牛血清；KCl。

1.1.2细胞BHK21。细胞BHK21购自中国兽药监察所，由中农威特生物科技股份有限公司质量保证部保存，按常规组织培养法进行培养和传代。

1.1.3培养基。MEM细胞培养基为GIBCO公司产品，MEM SLM低血清细胞培养基为北京清大天一生物技术有限公司产品，新生牛血清为兰州民海生物技术公司产品。

1.2方法

1.2.1细胞培养。将复苏的BHK21细胞在T75培养瓶中适应低血清培养基培养32代，其中，F1～F8代为传统201培养液+10%血清培养的BHK21细胞，F9～F16代为商业化低血清培养基+5%血清培养的BHKL21细胞，F17～F25代为商业化低血清培养基+4%血清培养的BHKL21细胞，F26～F32代为商业化低血清培养基+3%血清培养的BHKL21细胞。

1.2.2染色体标本制备。参照《四种动物传代细胞染色体遗传变异率分析》中染色体标本制备的方法。将5代、10代、20代、30代作为细胞染色体分析的代次，于细胞终止培养前5～6 h，在细胞培养物中加入适量的秋水仙素溶液，使秋水仙素的终浓度为0.01 μg/mL培养液，以便阻止细胞有丝分裂至中期，至培养结束时，倾弃培养液加入适量25 g/L胰蛋白酶消化液对细胞单层进行消化，收集细胞，再加入预热至37 ℃的75 mmol/L KCl溶液5～6 mL，室温下低渗30 min，离心倾弃上清液；然后加入固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)5 mL固定30 min后，800～1 000 r/min离心10 min，重复固定1次，置于4 ℃过夜，次日离心倾弃上清液，沉淀加1 mL新配制的固定液制成细胞悬浮液，在冰水浸泡的干净玻片上滴加细胞悬浮液3～4滴，室温下晾干，即制成培养细胞有丝分裂中期的染色体玻片标本。

1.2.3染色体的Giemsa染色[5]。染色体玻片标本于室温下放置7 d，或37 ℃干燥2～4 h后，即可进行染色体的Giemsa染色，用pH 6.8的磷酸盐缓冲液配成100 g/L的Giemsa染色液，滴在染色体玻片标本上，染色30 min，蒸馏水冲洗干净，晾干。

注：a.F4在201培养液+10%血清中的细胞形态；b.F9在MEM SLM+5%血清中的细胞形态;c.F18 在 MEM SLM+4%血清中的细胞形态；d.F27在MEM SLM+3%血清中的细胞形态。　Note: a. Cell morphology of F4 (201 culture liquid + 10% serum); b. Cell morphology of F9 (MEM SLM + 5% serum); c. Cell morphology of F18 (MEM SLM + 4% serum); d. Cell morphology of F27 (MEM SLM + 3% serum). 图1　驯化稳定4个代次BHK21细胞48 h培养形态Fig. 1　Cultivation morphology of four generations of BHKL21 cells at 48 h after stable domestication

1.2.4染色体的观察与分析。每个代次选择100个中期分裂相细胞，在油镜(10×100)下计数染色体数目，并观察记录畸变染色体，计算出染色体的畸变率，每种血清含量培养的细胞选择1个分裂良好的中期分裂相拍摄显微照片，并进行核型分析。

2　结果与分析

细胞驯化过程中，每个代次BHK21细胞长势稳定，形态良好(图1)。BHK21是源于幼仓鼠肾的一种传代细胞系[6-7]。共计数了BHK21细胞系的5代、10代、20代和30代400个中期分裂相的染色体，染色体数目分布见表1。由表1可知，BHK21属于亚二倍体和亚四倍体系，5代、10代和30代主要是亚二倍体细胞系，其中，亚二倍体细胞染色体数目32～67，所占比例分别为76%、80%和79%，亚四倍体细胞染色体数目为68～87，所占比例分别为23%、20%和20%。20代主要是亚四倍体细胞，染色体数目为68～87，所占比例为68%。染色体的畸变率在各代次所占比例为0～2%，染色体畸变率很低。因此，该细胞经驯化，用低血清培养基培养后，不同的血清用量，各代次之间无本质差异，遗传学特性相对稳定，故可候选为制苗用细胞。4个代次细胞中期分裂相见图2。

表14个代次染色体数目分布

Table 1Distribution of four generations of chromosome number

细胞代次Cellge-neration染色体数目范围Rangeofchromosomenumber∥个各范围所占细胞数Cellpopulationineachrange∥个所占比率Percentage%畸变率Deformationrate∥%532～505252051～672424068～87232301091111032～506060051～672020068～87202002032～501212051～6788068～8768680112～1142223032～506161051～671818068～8720200121111

3　结论

用商业化的代血清培养基驯化培养BHK21细胞，逐渐降低培养液中的血清含量，进行传代培养，通过选取不同代次细胞的染色体进行核型分析。结果表明，该细胞系的遗传学特性相对稳定，各代次间无本质差异，可候选为制苗用细胞。

[1] 张桂林，卫小静，郑梅玲.918例孕中期羊水细胞染色体核型分析[J].中华医学遗传学杂志，2012,29(1)：102-104.

[2] 张旺东，王秋菊.染色体核型分析在白血病分型诊断和预后判断中的临床意义[J].国际检验医学杂志，2010,31(12)：1359-1363.

[3] 翁炳焕，任宇珂，朱瑞建，等.染色体制备及核型分析室内控制标准及其考评标准的探讨[J].中国产前诊断杂志，2013,5(2)：40-44.

[4] 黄燕，陈绍坤.动物骨髓细胞染色体标本制备失败的原因分析[J].生物学通报，2006,42(1)：52-54

[5] 郭健民,张耀平,刘瑞清，等.常用实验动物肿瘤染色体的研究[J].遗传学报,1980，7(4):376-381.

[6] UMENE K, NISHIMOTO T. Replication of herpes simplex virustype 1 DNA is inhibited in a temperature-sensitive mutant of BHK-21 cells lacking RCC1(regulator of chromosome condensation)and virus DNA remains linear[J].J Gen Virol,1996，77(10):2261-2270.

[7] ISLAM M Q，ISLAM K，LEVAN G，et al. Monochromosome transfers to syrian hamster BHK cells via microcell fusion provide functional evidence for suppressor genes on human chromosome 9 both for anchorage independence and for tumorigenicity [J].Genes Chromosomes Cancer,1995，13(2):112-115.

Chromosome Genetic Stability Analysis of BHK21 Cells with Low Serum Culture

CHEN Miao-miao, DONG Jin-jie, DU Ping

(China Agricultural VET. BIO. Science and Technology Co., Ltd., Lanzhou, Gansu 730046)

[Objective] To analyze a commercialization low serum medium, which was suitable for subculture of BHK21 cells, to analyze the variation stability of the cell chromosome to determine its quality. [Method] Direct method was used to prepare chromosome specimens of 4 four generations BHK21 cells. Conventional Giemsa staining was adopted. The number of metaphase mitotic chromosomes was counted by 1 000 times of optical microscope, so as to find the rate of chromosome mutation, and to carry out karyotype analysis. [Result] BHK21 was a sub diploid or tetraploid cell line. The hypodiploid mode was 42, hypotetraploid cell mode was 72-74 .The chromosome aberration rate of the cell line was 0-2%., which was lower than that of the generation. [Conclusion] The genetic characteristics of the cell line are relatively stable, there is no essential difference between the generations, and it can be used as a candidate for the production of cells.

Low-serum; BHK21; Chromosome; Genetic stability

国家高新技术研究发展计划项目(“863”计划 2011AA10A211)。

陈苗苗(1980- ),女，四川广元人，助理研究员，硕士，从事生物制品研发工作。

2016-07-06

S 188

A

0517-6611(2016)23-097-02