粤北地区梅花猪链球菌的分离鉴定和药敏试验

周　迪，杨旭夫，彭　凌，刘博婷

(韶关学院/粤北生猪生产及疫病防控协同创新发展中心，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所-韶关学院动物疫病诊断中心联合实验室,广东韶关 512005)



粤北地区梅花猪链球菌的分离鉴定和药敏试验

周迪，杨旭夫*，彭凌，刘博婷

(韶关学院/粤北生猪生产及疫病防控协同创新发展中心，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所-韶关学院动物疫病诊断中心联合实验室,广东韶关 512005)

对来自粤北某梅花猪养殖基地存在的不同程度呼吸道症状和无症状梅花猪，采取鼻腔拭子进行细菌性疾病调查，通过对优势菌的观察、分离纯化、染色镜检、生理生化试验和16 S rRNA基因序列比对分析，确定2株优势菌为猪链球菌。荚膜多糖抗原(CPS)基因分型确定1株为猪链球菌9型，另1株为28型。药敏试验结果表明，2株猪链球菌对12种抗菌药物敏感，对17种抗菌药物不敏感。

猪链球菌；16 S rRNA基因； CPS分型；药敏试验

猪链球菌(Streptococcussuis)不仅是一种重要的猪传染性疾病病原菌，而且是一种人兽共患病的病原体，能引起猪和人脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎及其他疾病，其血清型众多，在给世界范围内养猪业带来严重经济损失的同时[1-3]，对人类健康也构成了巨大威胁。

畜禽品种资源是生物多样性的重要组成部分[4]，梅花猪是闻名广东的优良地方猪种，因原产于韶关市乐昌梅花镇而得名。该品种具有种猪利用年限长、适应性强、耐粗饲、生长快、皮薄、肉嫩、味道鲜美等独特的品质，是国内外许多品种所没有的。有调查显示，该品种猪繁殖性能出现下滑趋势，数量锐减，已经到了濒临灭绝的境地[5-6]。因此，除对梅花猪的品种资源、遗传保种工作迫在眉睫外，对养殖过程中疾病的监测和防控也显得极其重要。我们对粤北某梅花猪养殖基地存在不同程度呼吸道症状的保育猪及不存在明显症状的外表健康的保育猪、育肥猪采集鼻腔拭子，进行细菌性疾病的调查，结果报告如下。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病料无菌采集粤北某基地存在严重和一般呼吸道症状的梅花猪保育猪，以及不存在明显症状的健康保育猪和育肥猪鼻腔拭子共28份。

1.1.2培养基牛心浸汁琼脂培养基，本实验室自制；含马血清的MH培养基，为商品培养基按照说明融化灭菌后，加入50 mL/L无菌马血清倾倒平板制成。

1.1.3试剂细菌微量生化反应管和药敏纸片,杭州滨和微生物试剂有限公司产品；TaKaRa ExTaq、 DNA Marker，宝生物工程(大连)有限公司产品；基因组DNA抽提试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司产品。

1.2方法

1.2.1细菌的分离培养样品棉拭子涂布接种于含100 mL/L马血清的牛心浸汁琼脂平板，37℃蜡烛缸培养24 h后观察菌落形态。选取存在明显优势菌的平板，挑取可疑单菌落接种于血清营养琼脂平板进行纯化培养。从纯化后的培养平板中挑取单个菌落进行革兰染色镜检、形态观察。

1.2.2生化试验参照《伯杰氏细菌学鉴定手册》猪链球菌的生化鉴定标准，用分离得到的菌株纯培养物进行蔗糖、乳糖、蕈糖、山梨醇、菊糖、七叶甘、马尿酸盐、淀粉水解等生化试验。

1.2.3细菌基因组DNA的提取从分离菌的纯培养平板中挑取单菌落接种于血清营养肉汤中培养，离心收集适量菌体。基因组DNA的提取按照上海生工生物工程技术服务有限公司Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒说明书进行。

1.2.416 S rRNA基因序列鉴定参照文献[7]，引用其设计的16 S rRNA基因引物，引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列信息为：F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， R: 5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，产物长度约1 500 bp。反应体系：10×ExTaqbuffer(Mg2+free) 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)4 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 4 μL，正、反向引物(20 μmol/L)各1 μL, 基因组DNA模板(10 ng～100 ng)1 μL，TaKaRa ExTaq(5 U/μL)0.25 μL，加超纯水定容至50 μL。反应条件按文献[7]中推荐的进行，产物经检测后寄送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.5荚膜多糖抗原(CPS)基因分型鉴定用实验室保存的分别对应猪链球菌1、2、7、9型的猪链球菌引物CPS1J、CPS2J、CPS7H、CPS9H，对2株猪链球菌进行基因分型鉴定，引物序列信息参照文献[8]，产物片段长度为别为637、498、379、303 bp。以及参照文献[9]，合成文献中的全部35对引物，采用两步多重PCR法对上述1、2、7、9型引物不能鉴定的菌株重新分型鉴定，第一步用7重PCR将35种CPS型分为7个群，第二步用各群中相应的型特异性引物进行多重PCR分型鉴定，产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6药敏试验采用纸片扩散法，将所分离到的菌株纯培养物稀释后均匀涂布于添加50 mL/L马血清的MH平板上，按杭州滨和微生物试剂有限公司纸片法药敏试验操作方法,将抗菌药物药敏纸片贴于平板上。37℃厌氧培养24 h后观察结果。判定标准根据各菌属药物纸片说明进行。

2　结果

2.1猪源链球菌的分离、培养特性及涂片镜检观察

2株优势菌在含有马血清的牛心浸汁琼脂上厌氧培养生长良好，能形成圆形、闪光、灰白色、半透明和边缘整齐的小菌落，编号分别为MS1和MS2。革兰染色均为阳性球菌，多呈单个存在，菌株MS1有少部分呈短链状；菌株MS2部分呈中长链状。

2.2生化试验结果

分离菌株的生化特性如表1，查阅《伯杰氏细菌鉴定手册》1998版，显示2株优势菌符合猪链球菌生化特性。

2.316 S rRNA基因序列鉴定

如图1所示，2个菌株均能扩增出预期大小的片段。测序结果经DNA Baser软件编缉后获得有效序列长度分别为1 445 bp、1 421 bp，将编缉后的序列用Blast在线比对工具进行同源性比对，结果显示,Identities值高达99%的菌株均为猪链球菌，从而确定2个菌株为猪链球菌。

表1　分离菌株的生化特性

M.DNA 标准DL 2 000;1.MS1；2.MS2

M.DNA Marker DL 2 000;1.MS1;2.MS2

图116 S rRNA 基因PCR扩增产物

Fig.1PCR products of 16 S rRNA gene

2.4荚膜多糖抗原(CPS)基因分型鉴定

用猪链球菌CPS基因1J、2J、7H、9H分型引物分别2个菌株进行PCR分型鉴定，其中MS2猪链球菌经扩增得到与9型预期大小的特异性片段，确定为猪链球菌9型(图2)。用新合成的引物对菌株MS1分型，如图3所示，第一步7重PCR显示其CPS群为第3组，该组包括21型、28型、29型、30型4种，两片段的大小分别为146 bp、583 bp。第二步四重PCR分型，产物结果显示片段大小与28型272 bp相符，确定MS1为猪链球菌28型。

M.DNA 标准DL 2 000;1.MS2

M.DNA Marker DL 2 000;1.MS2

图2菌株MS2 CPS分型鉴定

Fig.2CPS typing of srain MS2

2.5药敏试验结果

药敏试验结果表明，分离到的2株猪链球菌对青霉素G、羧苄青霉素、头孢唑啉、头孢曲松、头孢拉定、头孢唑啉、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、左氟沙星、利福平和替考拉宁高度敏感；对强力霉素、呋喃妥因、氯霉素、洛美沙星和诺氟沙星中度敏感；对氨曲南、克林霉素、卡那霉素、克拉霉素、庆大霉素、林可霉素、罗红霉素、阿奇霉素、链霉毒、红霉素、头孢克肟、头孢呋辛、阿米卡星、依诺沙星、磺胺异恶唑、呋喃唑酮和四环素等17种药物不敏感。

M.DNA 标准DL 2 000;1.MS1 CPS群分型;2.MS1特异性CPS分型

M.DNA Marker DL 2 000;1.CPS grouping for MS1;2.Specific CPS typing for MS1

图3菌株MS1 CPS分型鉴定

Fig.3CPS typing of srain MS1

3　讨论

本研究从粤北某梅花猪养殖基地存在严重程度不同的呼吸道症状的梅花猪保育猪，以及不存在明显临床症状的外表健康保育猪和育肥猪采集鼻腔拭子共28份进行细菌性疾病的检测，经形态观察和生理生化鉴定，初步确定2株优势菌为猪链球菌。PCR扩增16 S rRNA基因，序列经编缉、Blast分析比对，显示同源性高达99%的菌株均为猪链球菌，进而确定2株菌为猪链球菌，分别编号为MS1和MS2。用实验室保存的1、2、7、9型CPS分型引物对两个分离株进行分型鉴定，PCR结果显示，MS2能扩增出与9型预期的303 bp特异性片段，确定为猪链球菌9型。参照文献[9]，新合成引物，采用文献中的二步多重PCR法对MS1进行分型，结果显示CPS分群、CPS分型两步中分别能扩增出与文献报道的28型相符的、预期大小分别为146、583、272 bp特异性片段，确定为猪链球菌28型。在现有的35种血清型中，从发病猪中分离到的猪链球菌大多属于血清1～9型，血清2型在大多数国家发病猪中都占主导地位[10]，近年来9型也成为临床上猪链球菌感染常见的血清型[11]。猪链球菌的毒力因子相当复杂，潜在的毒力菌株与临床表现未必一致[10]，此次分离到的9型菌株MS2是从无临床症状的健康育肥猪鼻腔中分离的优势菌，几种毒力相关基因sly、epf、mrp、arcA、hyl和bay检测发现，其毒力相关基因谱为mrp+/bay+，其余毒力因子未检测到(本实验室，未发表资料)，与修福晓等[11]、Wang K等[12]分离的某1株9型猪链球菌毒力基因相关谱相似。没有使猪发病的可能原因是MS1毒力相关基因变异导致该分离株毒性减弱，或潜在的重要的毒力基因的缺失，或者是处于感染的初期及潜伏期阶段。尽管如此，基地相关工作人员应在环境卫生条件降低、季节变换等应激情况下密切关注猪只的健康状况，及早做好疾病预防控制措施。到目前为止，关于28型猪链球菌的分离鉴定鲜有报道，Wang K等[12]2012年在屠宰猪中分离到2株28型猪链球菌，并对其毒力相关基因谱进行了分析，发现毒力相关基因型为mrp-/epf-/sly-。本次分离到的MS1是从存在严重呼吸道症状的保育猪鼻腔中分离到的优势菌，毒力相关因子检测为arcA+/ bay+，提示该菌与猪只发病之间可能的相关性，关于该28型分离株的毒力及致病力还有待做进一步的研究。

抗菌药物作为抗感染的主要药物，对维护人类和畜禽的健康发挥了重要作用[13]。近年来，抗菌药物的不规范使用导致耐药性菌株大幅上升，增加了对疾病预防和控制的难度。为指导临床用药，本报道选用了临床上常用的34种药物进行药敏试验，结果显示，2个菌株对临床上常见的12种药物敏感，但对大环内酯类、四环素类、磺胺类药物、呋喃类等多达17种药物不敏感，耐药率高达50%，耐药性较严重。2株不同型猪链球菌具有相似的药物敏感性，分析原因可能是：该基地多年来的用药习惯造成细菌产生规律性耐药；药物敏感性基因可能是由质粒控制，质粒经水平传递分布到不同的分离菌株中，从而造成了不同分离株具有相同的药敏特征。建议该基地以保护和利用畜禽品种资源为出发点，结合临床症状、药敏试验结果，在养殖过程中合理用药，科学防控。

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Isolation,Identification and Drug Susceptibility Test of Streptococcus suis from Plum Flower Pigs in Northern Area of Guangdong Province

ZHOU Di,YANG Xu-fu,PENG Ling,LIU Bo-ting

(Center of Collaborative Innovation and Development on Swine production and Disease Nontrol in Northern Guangdong,ShaoguanUniversity,JointLaboratoryofAnimalInfectionsDiseasesDiagnosticCenterHarbinVeterinaryResearchInstitute,COAS-ShaoguanUniversity,Shaoguan,Guangdong,512005,China)

To investigate bacterial diseases of Plum flower pigs,nasal swabs were sampled from the pigs with clinical respiratory symptoms of varying degrees and no symptoms.Two strains of dominant bacteria were obtained on the medium of bovine heart infusion agar, and identified asStreptococcussuisby a series of tests such as purified culture,morphological characteristics,staining and microscopy,physiological and biochemical tests and 16 S rRNA sequence alignment and analysis.One of the strains was serotyped as serovar 9 and the other was as serovar 28 by PCR amplification with primers CPS of 35 serovars ofS.suis.The results of drug susceptibility test showed that two strains ofS.suiswere susceptible to 12 antimicrobials,and were resistant to 17 antimicrobials.

Streptococcussuis; 16 S RNA gene;CPS typing;drug susceptibility test

2016-01-28

“粤北生猪生产及疫病防控协同创新发展中心”平台项目；广东省公益研究与能力建设专项资金项目(2014A020208140)

周迪(1984-)，女，江西宜春人，助理实验师，硕士，主要从事兽医微生物及分子生物学研究。*通讯作者

S852.611;S858.28

B

1007-5038(2016)09-0125-04