青藏高原牦牛感染BVDV和BEV的分子流行病学调查

陈新诺，张朝辉，徐　林，唐　川，余　劲，李　劲，廖　昆，汤　承，张　斌*

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041；2.四川省甘孜州动物疾病预防控制中心，四川康定 626000)



青藏高原牦牛感染BVDV和BEV的分子流行病学调查

陈新诺1，张朝辉2*，徐林2，唐川2，余劲2，李劲2，廖昆2，汤承1，张斌1*

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041；2.四川省甘孜州动物疾病预防控制中心，四川康定 626000)

为了解青藏高原地区牦牛牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛肠道病毒(BEV)的感染情况,应用RT-PCR对青藏高原地区(西藏、青海、四川和云南)共计222份出现腹泻症状的牦牛粪便样品开展了分子流行病学调查。从222份样品中，检出44份BVDV阳性，BVDV阳性检出率为20%(95% CI：15.5%～25.6%)；检出65份BEV阳性，BEV阳性检出率为29.4%(95% CI：24.1%～35.0%)；BVDV/BEV混合感染阳性率为4.8%(95% CI：2.5%～8.0%)。结果表明，所有被检地区牦牛均存在BVDV和BEV感染，且部分地区感染较为严重，有混合感染的情况。研究结果旨在为青藏地区牦牛腹泻的综合防控措施提供基本数据，丰富BVDV和BEV的分子流行病学调查资料。

青藏高原；牦牛；牛病毒性腹泻病毒；牛肠道病毒；分子流行病学调查

牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一种极为复杂、呈多临床类型表现的传染性疾病，以发热、白细胞下降、腹泻、消化道黏膜糜烂、溃疡、母畜流产、产死胎或畸形胎为主要特征[1]，一年四季均可发生，各种年龄均可发病，以3岁以上的母牦牛发病居多。BVDV属黄病毒科、瘟病毒属，是一种重要的动物疫病病原，在全球范围内广泛分布[2]。BVDV进入机体后可造成持续性感染与免疫抑制，持续感染牛的血清抗体为阴性，但却终身带毒与排毒[3]。牛肠道病毒(Bovine enterovirus，BEV)属于小RNA病毒科、肠道病毒属，呈球形，大小为25 nm～30 nm，为无囊膜单股正链RNA病毒。牛肠道病毒病原性不明显，通常只引起轻度腹泻或隐性感染，但常因侵犯其他器官而引起各种临床综合征，或者在一定条件下引发显著症状。BVDV被证实后，发现其在世界范围内流行，在养牛业发达的地区较为严重。自传入我国后，各地牦牛产区陆续报道本病。近年来的血清流行病学表明[4-6]，该病在牦牛中广泛流行，因牦牛生存环境特殊，且青藏高原当地牧民预防意识不强，BVDV的感染情况十分严重，危害牦牛生产，给当地牧民造成了巨大的经济损失。本研究对青藏高原地区的222份腹泻牦牛的粪便样本进行了BVDV和BEV感染情况的分子流行病学调查，以期为牦牛BVDV和BEV的防控提供基础资料。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂与仪器QuickTaqHS DyeMix，Toybo-东洋纺生物科技有限公司产品；DNA MarkerⅡ、Prime ScriptTMRT试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司产品；Tirzol试剂盒(RNAiso Plus)，上海英骏生物科技有限公司产品；高速离心机5804，Eppendor公司产品;普通PCR仪、核酸蛋白电泳仪、凝胶成像系统VersaDoc2000，Bio-Rad公司产品。

1.1.2引物参照文献[7-8]中引物序列，分别合成针对BVDV、BEV的2对特异性引物(表1)，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1　引物序列

1.2方法

1.2.1样品采集与处理2015年在青藏高原 (西藏、青海、四川和云南)4个省区分别采集发生腹泻症状的牦牛粪便样品共计222份(西藏70份，青海60份，四川59份，云南33份)，按照采集地分别标记编号。

将粪便样品按1∶5加入灭菌生理盐水研磨，经反复冻融后，按每毫升加入青霉素、链霉素各1 000 单位，以3 000 r /min 离心20 min，取上清液。

1.2.2总RNA提取和反转录参照上海英骏生物科技有限公司Trizol试剂盒(RNAisoPlus)说明书，提取牦牛BVDV总RNA。取病毒悬液500 μL加入700 μL的Trizol，室温静置10 min；加入 200 μL氯仿，强烈振荡15 s，室温静止5 min；4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液；加入等体积的异丙醇充分颠倒混匀，室温静置 10 min；4℃、12 000 r/min离心15 min，弃上清液，加入1 mL 750 mL/L(经 DEPC处理过的灭菌水配制)乙醇；4℃、12 000 r/min离心5 min，弃上清液，用 15 μL经 DEPC处理过的无菌水溶解沉淀，置-70℃保存备用。利用Prime ScriptTMRT试剂盒将RNA反转录成cDNA，并置于-20℃保存待用。

1.2.3BVDV的PCR的扩增与检测以反转录后的cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系如下：QuickTaqHS DyeMix 5 μL，上、下游引物均为10 pmol/L各0.5 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O 3 μL ;PCR反应条件为：94℃ 2 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，68℃ 1 min，共35个循环；72℃ 8 min；4℃终止反应。取扩增产物经琼脂糖凝胶核酸电泳和凝胶成像扫描仪进行检测与分析。

1.2.4BEV的PCR扩增与检测以反转录后的cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系如下：QuickTaqHS Dye Mix 5 μL，上、下游引物均为10 pmol/L各0.2 μL，cDNA模板0.8 μL，加ddH2O 3.8 μL ；PCR反应条件为：94℃ 2 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，68℃ 1 min，共35个循环；72℃ 8 min；4℃终止反应。取扩增产物经琼脂糖凝胶核酸电泳和凝胶成像扫描仪进行检测与分析。

2　结果

2.1BVDV RT-PCR检测

222株出现腹泻症状的牦牛粪便样品中，BVDV中有44份扩增出了特异性条带，BVDV阳性检出率为20%(95% CI：15.5%～25.6%)。部分样品的PCR扩增结果见图1。

2.2BEV RT-PCR检测

222株出现腹泻症状的牦牛粪便样品中，BEV中有65份扩增出了特异性条带，BVDV阳性检出率为29.4%(95% CI：24.1%～35.0%)。部分样品的PCR扩增结果见图2。

对收集的青藏高原地区的222份牦牛粪便进行BVDV和BEV核酸检测，从222份样品中， BVDV阳性检出率为20%(95% CI：15.5%～25.6%)(表2)。BEV阳性检出率为29.4%(95% CI：24.1%～35.0%)。BVDV/BEV混合感染阳性率为4.8%(95% CI：2.5%～8.0%)。其中，西藏BVDV阳性检出率为18.1%(95% CI：9.8%～27.2%)， BEV阳性检出率为47.4%(95% CI：36.2%～59.1%)。BVDV/BEV混合感染阳性率为7%(95% CI：2.5%～13.8%)。青海BVDV阳性检出率为35.6% (95% CI：24.1%～48.2%)， BEV阳性检出率为25.8%(95% CI：16%～37%)。BVDV/BEV混合感染阳性率为8.1%(95% CI：2.7%～16.6%)。四川BVDV阳性检出率为4.9% (95% CI：0.9%～10.9%)， BEV阳性检出率为16.3%(95% CI：8%～27.3%)。云南BVDV阳性检出率为28.4% (95% CI：14.9%～44.1%)， BEV阳性检出率为25.6% (95% CI：12.6%～40.8%)。BVDV/BEV混合感染阳性率为8.4%(95% CI：1.7%～19.2%)。可见不同地区的牦牛感染BVDV、BEV的感染率不同，BVDV/BEV混合感染情况也不同。

M．DNA标准Ⅱ；N.阴性对照；1～8.样本 M．DNA Marker Ⅱ；N．Negative control；1-8．Samples图1　BVDV RT-PCR扩增结果Fig.1　Amplified results of BVDV by RT-PCR

M．DNA标准Ⅱ；N.阴性对照；1～8.样本 M．DNA MarkerⅡ；N．Negative control；1-8．Samples图2　BEV RT-PCR扩增结果Fig.2　Amplified results of BEV by RT-PCR表2　BVDV和BEV阳性检出率Table 2　The positive detection rates of BVDV and BEV

样本来源Samplesource样本数量/份SampleNo.BVDV检出率/%PositiveratesofBVDVBEV检出率/%PositiveratesofBEVBEV/BVDV检出率/%PositiveratesofBVDV/BEV西藏Tibet7018.1(9.8～27.2)47.4(36.2～59.1)7(2.5～13.8)青海Qinghai6035.6(24.1～48.2)25.8(16～37)8.1(2.7～16.6)四川Sichuan594.9(0.9～10.9)16.3(8～27.3)0云南Yunnan3328.4(14.9～44.1)25.6(12.6～40.8)8.4(1.7～19.2)

3　讨论

牦牛多生存于海拔3 000 m～5 000 m及以上的青藏高原地区，是典型的高原物种之一，具有“高原之舟”之称。牦牛广泛分布于中国青藏高原地区(西藏、青海、四川、云南)及其相邻的高原地区。我国牦牛资源较为丰富，牦牛数量较多，据统计我国约有1 300多万头牦牛，占世界牦牛总数的90%以上[9]。在青藏高原地区，牦牛作为最重要的高原生存物种之一，具有产肉、产奶、皮革和绒毛生产等多方面的经济价值[10]。

BVDV是导致牦牛腹泻的重要病原，BVDV感染牦牛后可导致牛奶产量下降，牛奶品质差，繁殖力降低，生长迟缓和继发感染其他疾病。据调查，该病在我国大部分地区广泛存在，牛群中相当一部分是BVDV的携带者[11]。在国外牛群中，BEV感染阳性率高达17.6%～80%。BEV通过粪-口传播，传染源主要为病牛和无症状的病毒携带者。近年来，在我国的牛群中也不断发现有BEV的存在。在我们前期研究中，利用宏病毒组学在腹泻牦牛的粪便中发现了BEV，且具有相对高的检出率。自青海第1例BVDV感染的血清学检测开始，大量的调查显示BVDV抗体血清阳性率为0.56%～72.14%[4-6]。2012年青海牦牛血清样品中BVDV抗体阳性率为54.15%，四川红原牦牛血清样品中抗体阳性率为45.25%。2013年西藏牦牛血清样品中BVDV抗体阳性率为54.15%，四川红原牦牛血清样品中BVDV抗体阳性率为45.25%。可以看出，在3年的血清流行病学调查中，西藏牦牛血清样品中BVDV抗体阳性率下降了20.32%，青藏地区下降了17.99%，四川红原上升了10.78%，但3个省区的整体水平仍然较高。本调查应用PCR从2013年青藏高原地区的20份腹泻牦牛粪便样品中检测病毒流行情况，BVDV阳性率为15%，BEV阳性率为30%[8]。而本研究用PCR检测2015年青藏地区腹泻牦牛222份粪便样品，BVDV阳性率为20%，BEV阳性率为29.4%；两者检测结果大致相同。根据本研究结果可见，青藏高原不同省区的牦牛感染BVDV、BEV的感染率不同，各个省区的牛场BVDV/BEV混合感染的情况也不同。目前还没有牦牛专用的BVDV和BEV疫苗，因此，需要根据当地情况及时做好防控工作，建立严格的饲养管理及兽医防疫制度，加强重视区域性防控，降低BVDV、BEV感染率以及混合感染的情况。

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Investigation on Molecular Epidemiology of BVDV and BEV Infections in Yaks of Qinghai-Tibetan Plateau

CHEN Xin-nuo1,ZHANG Chao-hui2,XU Lin2,TANG Chuan2,YU Jin2,LI Jin2,LIAO Kun2,TANG Cheng1,ZHANG Bin1

(1.College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu，Sichuan， 610041,China；2.DiseasePreventionandControlCenterofGanziTibetaAutonomousPrefectureofSichuanProvince,Kangding，Sichuan， 626000,China)

In order to investigate the prevalence and distribution of bovine viral diarrhea virus and bovine entero virus infections in yaks of Qinghai-Tibetan Plateau,this study used RT-PCR to carry out molecular epidemiological investigation on a total of 222 diarrhea samples of yak feces collected from Qinghai-Tibetan Plateau(Tibet,Qinghai,Sichuan,Yunnan).From 222 samples,44 samples were detected as BVDV positive,BVDV positive rate was 20%(95% CI：15.5%-25.6%)and 65 samples were detected as BEV positive,BEV positive rate was 29.4%(95% CI：24.1%-35.0%);the positive rate of mixed infection of BVDV/BEV was 4.8%(95% CI：2.5%-8.0%).The results showed that BVDV and BEV existed in all areas of the samples collected,and the yaks in part of regions were infected seriously.This study provided the basic data for the comprehensive prevention and control of BVDV and BEV infections in yaks of Qinghai-Tibetan Plateau,and enriched the data for BVDV and BEV epidemiological investigation.

Qinghai-Tibetan Plateau;yak;Bovine viral diarrhea virus;Bovine enterovirus;molecular epidemiological investigation

2015-12-26

四川省科技计划项目(2014JQ0044)；西南民族大学研究生创新型科研项目(CX2016SZ091)

陈新诺(1992-)，女，辽宁沈阳人，硕士研究生，主要从事青藏高原牦牛疾病研究。*通讯作者

S855.3

A

1007-5038(2016)09-0035-04