不同剂量MPTP所致帕金森病小鼠模型焦虑行为的评价

叶素贞，施剑，夏誉，张书平，黄汉津

（1.温州医科大学附属第一医院 康复医学科，浙江 温州 325015；2.绵阳市中心医院 神经内科，四川 绵阳 621000；3.温州医科大学附属第一医院 急诊医学科，浙江 温州 325015；4.乐清市人民医院 神经内科，浙江 温州 325600；5.温州医科大学附属第二医院 神经内科，浙江 温州 325027）



不同剂量MPTP所致帕金森病小鼠模型焦虑行为的评价

叶素贞1，施剑2，夏誉3，张书平4，黄汉津5

（1.温州医科大学附属第一医院 康复医学科，浙江 温州 325015；2.绵阳市中心医院 神经内科，四川 绵阳 621000；3.温州医科大学附属第一医院 急诊医学科，浙江 温州 325015；4.乐清市人民医院 神经内科，浙江 温州 325600；5.温州医科大学附属第二医院 神经内科，浙江 温州 325027）

目的：研究不同剂量1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）所致急性帕金森病（PD）小鼠模型的焦虑行为。方法：选取40只C57BL/6J小鼠，随机分为对照组、小剂量组、中剂量组和大剂量组，每组10只。用高架十字迷宫和明暗箱检测小鼠的焦虑行为。结果：各模型组小鼠在暗箱停留的时间较对照组均有增加，差异有统计学意义（P＜0.05），但各模型组间的差异无统计学意义（P＞0.05），各模型组间小鼠的穿箱次数差异亦无统计学意义（P＞0.05）；高架十字迷宫中各模型组小鼠进入开放臂次数（OE）、开放臂停留时间（OT）及开放臂停留时间百分比（OT%）与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），但各模型组间差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组比，小剂量组和中剂量组小鼠OT%显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：MPTP所致急性PD小鼠模型早期即会出现焦虑行为，但焦虑的严重程度与造模MPTP剂量无关。

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶；小鼠；焦虑；帕金森病

帕金森病（Parkinson’s disease，PD），又名震颤麻痹（paralysis agitans），是一种常见的中老年神经系统变性疾病，临床以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常为特征。然而，有文献报道除运动障碍外，约60%～80%的患者合并程度不同的精神障碍如抑郁、焦虑、睡眠障碍、痴呆及药物性精神障碍，对患者生活质量的影响往往比运动障碍更严重［1-2］。国内研究［3］发现，焦虑是PD患者常见的非运动症状（non-motor symptoms，NMS）之一，焦虑发生率为33.87%，而且PD并发焦虑患者的NMS发生率也高，严重影响PD患者的日常生活活动能力，降低生活质量。当前对PD合并焦虑的研究多集中在

对PD患者的临床观察［3-5］，在动物模型上得出的实验观察较为有限。本实验的目的在于观察用不同剂量1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）急性造模PD小鼠的焦虑行为。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1动物：雄性C57BL/6J小鼠40只，8周龄，体质量20～25 g，购自上海斯来克实验动物有限责任公司。清洁级饲养，昼夜节律12/12 h，动物可以自由获取食物和饮水。

1.1.2分组和模型制备：小鼠适应性饲养1周后，40只C57BL/6小鼠按体质量随机分为4组，每组10只。小剂量组（MPTP 20 mg/kg×1次，0.9%氯化钠溶液20 mg/kg×7次）、中剂量组（MPTP 20 mg/kg×4次，0.9%氯化钠溶液20 mg/kg×4次）、大剂量组（MPTP 20 mg/kg×8次）连续腹腔注射2 d，对照组0.9%氯化钠溶液20 mg/kg×8次，每次注射时间间隔2 h，每天4次，连续腹腔注射2 d。

1.2方法

1.2.1明暗箱实验：于造模后第3天进行。基于Crawley等［6］的实验设计，明暗箱的长宽高分别为44 cm×21 cm×21 cm，分为明箱和暗箱，明箱占2/3，暗箱占1/3，明暗箱之间有一通道可供小鼠通过。明箱上方有白炽灯照亮。实验室内保持安静，实验前动物在房间内先适应1 h。操作者将小鼠放入明箱正中，记录小鼠在箱内5 min的行为活动，用计时器记下小鼠停留在暗箱的时间，计数器记录明暗箱间的穿梭次数。

1.2.2高架十字迷宫：于造模后第4天进行。基于Lister［7］的实验设计，小鼠面对开放臂放至迷宫中心的公共区，用视频摄像系统记录小鼠5 min运动轨迹指标：①进入开放臂次数（open arm entry，OE）：进入到任一开放臂的次数，以小鼠4个爪子均进入到臂内为准，中途一个爪子从该臂中完全退出则为该次进入活动完成；②开放臂停留时间（open arm time，OT）；③进入封闭臂次数（close arm entry，CE）：进入任一封闭臂的次数，以小鼠4个爪子均进入到臂内为准；④封闭臂停留时间（close arm time，CT）。

1.3统计学处理方法 采用SPSS18.0软件进行统计分析。计量资料以表示，对4组数据比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐者采用LSD检验，方差不齐者采用Dunnett’T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1明暗箱测试结果 在明暗箱测试中，4组小鼠的穿箱次数不同（F=3.084，P＜0.05），但各造模组与对照组，以及各造模组间的差异无统计学意义（P ＞0.05）。4组小鼠在暗箱停留的时间差异具有统计学意义（F=3.253，P＜0.05），各剂量造模组小鼠暗箱停留时间与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但各剂量组之间的差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1　明暗箱的穿箱次数和在暗箱停留的时间（n=10，±s）

表1　明暗箱的穿箱次数和在暗箱停留的时间（n=10，±s）

与对照组比：aP＜0.05

组别　穿梭次数（次）　暗箱停留时间（s）对照组　8.8±1.8　142.5±18.6小剂量组　7.1±1.7　167.1±24.0a中剂量组　8.6±1.9　164.0±15.0a大剂量组　7.9±1.9　170.8±28.9a

2.2高架十字迷宫实验结果 在高架十字迷宫测试中，4组小鼠OE、OT、OE%、OT%的差异有统计学意义（P＜0.01）；其中OE、OT、OT%，小剂量组、中剂量组、大剂量组与对照组比，差异均有统计学意义（P＜0.05），但大剂量组和中剂量组、中剂量和小剂量组间差异无统计学意义（P＞0.05）；OE%小剂量组和中剂量组与对照组比差异均有统计学意义（P ＜0.05），但大剂量组与对照组间、大剂量组和中剂量组、中剂量和小剂量组间的差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2　小鼠在高架十字迷宫中的行为学结果（n=10，±s）

表2　小鼠在高架十字迷宫中的行为学结果（n=10，±s）

与对照组比：aP＜0.01

组别　OE（次）　OT（s）　OE%　OT%对照组　3.9±0.6a　34.9±11.9a　23.1±4.0a12.9±4.9a小剂量组　2.0±0.8a　15.3± 9.3a　14.4±5.0a5.4±3.4a中剂量组　2.3±1.0a　14.5± 9.5a　15.1±5.6a7.9±3.4a大剂量组　2.9±1.1a　21.7± 9.8a　19.6±5.8　7.8±4.8a

3　讨论

研究［8］发现，PD患者合并情感障碍，其中70%患者伴发抑郁，69%患者存在焦虑。MPTP是一种常用的PD造模药物，C57BL/6小鼠是目前已知对MPTP最敏感的动物，MPTP小鼠模型能很好的复制PD的神经病理和神经生化改变。MPTP本身不具有毒性作用，毒性为其活性代谢产物MPP+，它能选择性地损害黑质-纹状体系统的多巴胺（dopamine，DA）能神经元，进而导致DA的丢失，出现选择性的运动症状［9］。啮齿类动物的焦虑行为主要表现为探索本性和外界环境的矛盾冲突，其核心症状是担忧，直接的表现就是对不熟悉环境的躲避。

高架十字迷宫和明暗箱是目前比较公认的评价小鼠焦虑行为的方法［10］。明暗箱是评价啮齿类动物焦虑行为的经典方法，水平运动反映动物的一般活动习性，垂直运动反映动物对新鲜环境的探索活性，抗焦虑药物会增加动物在明箱的行为活动时间，而致焦虑剂明显减少明箱的停留时间，穿梭次数反映运动和探索活动，明箱停留时间反映抗焦虑状态；高架十字迷宫的OE%和OT%反映动物的焦虑状态［11-12］。

本实验发现明暗箱中各模型组小鼠在暗箱停留时间增加，明箱的停留时间缩短；而高架十字迷宫中结果发现各模型组小鼠OE、OT、OE%、OT%均有减少，这表明模型组小鼠出现明显焦虑症状。Levitskaya等［13］发现小鼠腹腔注射神经毒素MPTP（20 mg/kg）1次后便会增加动物的焦虑行为。Ho等［14］发现MPTP造模小鼠在注射后第1天即在高架十字迷宫实验中表现出焦虑行为。一项类似研究提示，基因敲除的PD小鼠在明暗箱实验中表现出明显焦虑行为［15］。张如意等［16］研究发现MPTP所致急性PD小鼠1 d及3 d后都出现不同程度爬杆时间延长，自发活动次数减少。研究［17-18］发现，MPTP所致PD模型C57BL/6J小鼠，在注射MPTP第1天后自主活动明显下降，但是注射后第2天基本恢复。本研究行为学评价分别在造模后第3、第4天进行，可相对减少MPTP所致C57BL/6J小鼠PD模型的运动障碍干扰。不同的研究对PD动物模型的自主活动或是运动障碍结果存在差异，这些行为学的差异与给药剂量、途径、时间以及动物品系来源不同有关［19］。本实验发现无论是明暗箱停留时间还是高架十字迷宫中的结果，各模型组之间的结果无明显差异，提示造模所用MPTP剂量大小与小鼠焦虑程度无关，这说明急性PD小鼠的焦虑症状并非只由MPTP剂量决定。然而，本实验缺少不同病程，如慢性模型的对照组别，因此不能确定MPTP所致PD模型的急性、亚急性与慢性模型间的焦虑障碍的区别。

在人体和焦虑动物模型中，纹状体DA受体的结合能力降低，焦虑障碍患者多巴胺摄取减少。此外，去甲肾上腺素、五羟色胺等也发挥重要作用，这些都提示焦虑与PD发病相关［20］。研究表明，五羟色胺在焦虑中发挥重要作用，而PD患者的五羟色胺系统异常。而且，中脑皮质边缘叶DA路径受累，DA含量减少可以加重情感障碍［3］，更重要的是，与非焦虑组相比，焦虑组“开关”现象发生率更高，这与脑内DA水平的变化相关。可见PD和焦虑在发病机制上存在一定相关性。

本实验成功制作PD模型，且明确提示动物模型存在明显焦虑症状，目前越来越多的流行病学和临床研究发现在经典的运动症状出现之前，已经出现了其他的NMS，如情感障碍和认知功能损害［21］，但动物模型不能完全模拟人体的各种生理病理机能，且焦虑与PD之间关系可能互为因果，不同剂量MPTP所致PD小鼠是否在亚急性期及慢性期会出现不同程度的焦虑症状不能确定，有待进一步研究。

［1］RABINSTEIN A A，SHULMAN L M. Management of behavioral and psychiatric problems in Parkinson's disease［J］. Parkinsonism Relat Disord，2000，7（1）： 41-50.

［2］GAGE H，HENDRICKS A，ZHANG S，et al. The relative health related quality of life of veterans with Parkinson's disease［J］. J Neurol Neurosurg Psychiatry，2003，74（2）： 163-169.

［3］刘卓,孙莉,黄曦妍,等. 帕金森病伴发焦虑与运动症状及非运动症状关系的研究[J]. 中华临床医师杂志(电子版),2012,6(2): 12-17.

［4］QUELHAS R，COSTA M. Anxiety，depression，and quality of life in Parkinson's disease［J］. J Neuropsychiatry Clin Neurosci，2009，21（4）： 413-419.

［5］李丽娟,李巧薇,谭少华,等. 帕金森病合并抑郁和焦虑的发生率及相关因素[J]. 广东医学,2009,30(2): 266-268.

［6］CRAWLEY J，GOODWIN F K. Preliminary report of a simple animal behavior model for the anxiolytic effects of benzodiazepines［J］. Pharmacol Biochem Behav，1980，13（2）：167-170.

［7］LISTER R G. The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse［J］. Psychopharmacology （Berl），1987，92（2）：180-185.

［8］ KULISEVSKY J，PAGONABARRAGA J，PASCUALSEDANO B，et al. Prevalence and correlates of neuropsychiatric symptoms in Parkinson's disease without dementia ［J］. Mov Disord，2008，23（13）： 1889-1896.

［9］ GORTON L M，VUCKOVIC M G，VERTELKINA N，et al. Exercise effects on motor and affective behavior and catecholamine neurochemistry in the MPTP-lesioned mouse［J］. Behav Brain Res，2010，213（2）： 253-262.

［10］ CRYAN J F，HOLMES A. The ascent of mouse： advances in modelling human depression and anxiety［J］. Nat Rev Drug Discov，2005，4（9）： 775-790.

［11］ 孙世光,乔明琦,张惠云. 昆明小鼠状态焦虑动物模型明暗箱实验的重测信度及参数相关性[J]. 中华行为医学与脑科学杂志,2011,20(3): 198-201.

［12］ 王丽娜,郭小兵,马金芳,等. 青年与老龄昆明小鼠焦虑动物模型结构维度比较[J]. 中华行为医学与脑科学杂志,2013,22(6): 514-516.

［13］ LEVITSKAYA N G，SEBENTSOVA E A，ANDREEVA L A，et al. The neuroprotective effects of semax in conditions of MPTP-induced lesions of the brain dopaminergic system ［J］. Neurosci Behav Physiol，2004，34（4）： 399-405.

［14］ HO Y J，HO S C，PAWLAK C R，et al. Effects of d-cycloserine on MPTP-induced behavioral and neurological changes： Potential for treatment of Parkinson's disease dementia ［J］. Behav Brain Res，2011，219（2）： 280-290.

［15］ ZHU X R，MASKRI L，HEROLD C，et al. Non-motor behavioural impairments in parkin-deficient mice［J］. Eur J Neurosci，2007，26（7）： 1902-1911.

［16］ 张如意,张兰,叶翠飞,等. MPTP对小鼠行为学及脑纹状体多巴胺含量的影响[J]. 中华行为医学与脑科学杂志,2001,10(3): 164-166.

［17］ JACKSON-LEWIS V，PRZEDBORSKI S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease［J］. Nat Protoc，2007，2（1）： 141-151.

［18］ PRZEDBORSKI S，JACKSON-LEWIS V，NAINI A B，et al. The parkinsonian toxin 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine （MPTP）： a technical review of its utility and safety［J］. J Neurochem，2001，76（5）： 1265-1274.

［19］ SEDELIS M，HOFELE K，AUBURGER G W，et al. MPTP susceptibility in the mouse： behavioral，neurochemical，and histological analysis of gender and strain differences ［J］. Behav Genet，2000，30（3）： 171-182.

［20］ KANO O，IKEDA K，CRIDEBRING D，et al. Neurobiology of depression and anxiety in Parkinson's disease［J］. Parkinsons Dis，2011，2011： 143547.

［21］ TOLOSA E，COMPTA Y，GAIG C. The premotor phase of Parkinson's disease［J］. Parkinsonism Relat Disord，2007，13 Suppl： S2-S7.

（本文编辑：赵翠翠，丁敏娇）

Evaluation the anxiety behavior in different dosage of MPTP-induced Parkinson's mice

YE Suzhen1，SHI Jian2，XIA Yu3，ZHANG Shuping4，HUANG Hanjin5. 1.Department of Rehabilitation Medicine，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015； 2.Department of Neurology，Mianyang Central Hospital，Mianyang，621000； 3.Department of Emergency Medicine，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015； 4.Department of Neurology，Yueqing People's Hospital，Wenzhou，325600；5.Department of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325027

Objective： To study the anxiety behavior in different dosage of 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine （MPTP） -induced Parkinson's mice. Methods： Forty C57BL/6J were randomly divided into 4 groups： Low-dose group （LG），moderate-dose group （DG），high-dose group （HG） and control group （CG）. The anxiety behavior in mice was tested with the elevated plus-maze test and the light/dark box. Results： The time of stayed in the dark box of model groups mice were longer than those of the control group （P＜0.05），but the time and transition among model groups mice had no difference （P＞0.05）. The OE，OT and OT% in mode groups mic were signifcant lower than that in the control group （P＜0.05） in the elevated plus-maze test，but there was no signifcant difference among the three model groups （P＞0.05）. The OE% in LG and DG was lower than that in control group （P＜0.05） in the elevated plus-maze test. Conclusion： Anxious behavior appears in the model groups of early PD mice. But there is no difference among those model groups. The anxiety behavior is not dose-dependent.

1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine （MPTP）； mice； anxiety； Parkinson's disease

R749.2

A DOI： 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.08.009

2015-12-08

叶素贞（1984-），女，浙江温州人，住院医师，硕士。

黄汉津，主任医师，教授，硕士生导师，Email：hhj@ wzmc.edu.cn。