聊城地区黄瓜靶斑病致病菌的鉴定与形态观察

马迪 王桂清

摘要：近年来聊城地区保护地黄瓜多发靶斑病。对病样进行分离、致病性测定、培养性状观察、形态学鉴定，尤其对孢子形态进行了详细的显微观察。结果表明，引起聊城地区黄瓜靶斑症状的病原菌为多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）。该菌在PDA培养基上菌落圆形，白色至浅灰褐色，平铺，质地致密，辐射状展开，边缘规则；菌丝淡褐色或灰黑色，具分枝和隔膜；分生孢子梗直或弯曲，浅褐色，不分枝，有分隔；分生孢子顶生，多单生，浅褐色，倒棍棒形或圆筒形，直或稍弯曲，壁光滑，具1个至多个隔膜，孢子长度为34.42～316.92 μm，宽度为11.45～22.45 μm。

关键词：黄瓜；靶斑病；致病菌；形态特征；多主棒孢霉

中图分类号：S436.421 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2016）06-0011-03

黄瓜靶斑病，又名褐斑病、棒孢叶斑病等，俗称“黄点病”，是近年来侵入设施黄瓜危害严重的一种病害，全国各地设施黄瓜均有发生。该病害严重影响植株光合作用[1]，使黄瓜产量减少、品质下降。20世纪60年代初，戚佩坤等人报道Corynespora cassiicola可侵染黄瓜，主要为害叶片[2]。在寄主黄瓜上，其症状与霜霉病和细菌性角斑病的发病症状相似，很难区分，以至于误用药剂防治，带来了严重后果，损失巨大。黄瓜靶斑病与细菌性角斑病的区别在于，前者病斑叶两面色泽相近，湿度大时上生灰黑色霉状物；而后者叶背面有白色菌脓形成的白痕，清晰可辨，两面均无霉层。黄瓜靶斑病与霜霉病的区别在于，靶斑病病斑枯死，病健交界处明显，病斑粗糙不平；而霜霉病病斑叶片正面褪绿、发黄，病健交界处不清晰，病斑很平。近年来，这3种病害在聊城地区保护地黄瓜上混合发生。为了明确引起圆形或不规则形、中央具一明显靶心症状的病害类型和致病菌种类，于2015年早春采集病样，对病原进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 病样采集与症状观察

2015年3月，于聊城市东昌府区庄行镇大棚栽培的有刺黄瓜叶片上采集类似靶斑病症状的叶片，记录症状，拍摄照片，制作标本。

1.2 病原菌的分离与纯化

以PDA培养基作为基本培养基，采用组织分离法对病斑进行分离，采用单孢分离法对分离菌进行纯化。以3%次氯酸钠作为表面消毒液，消毒时间3～5 min。分离和扩繁采用PDA平板，于25±1 ℃的恒温培养箱（玻璃门，自然光照）中培养4～7 d；纯化菌株保存采用PDA斜面，于上述条件下培养4～7 d 后，于4 ℃保存备用。

1.3 致病性鉴定

采用孢子悬浮液喷雾接种法进行致病性鉴定。将在PDA平板上培养4～7 d的菌株，用含2%的吐温-20的无菌水配制成孢子悬浮液，分生孢子浓度为103～104个/mL。活体接种：取生长良好、长出2片真叶的健康黄瓜苗，用上述孢子悬浮液喷雾接种到黄瓜叶片上，接种后用塑料薄膜保湿48 h，然后正常管理。离体接种：取健康无病斑的成株期黄瓜叶片，放置于覆有滤纸的大培养皿中（叶柄用脱脂棉包好，保湿），用上述孢子悬浮液喷雾接种，保湿培养。每天观察，记录发病情况。发病后再从发病部位取样进行再分离，以确定是否为致病菌。

1.4 病原菌的形态观察

通过柯赫氏法则验证，确定引起黄瓜靶斑病的病原。将供试菌株用直径5 mm的打孔器打取菌饼，接种到PDA平板上，于25±1 ℃培养箱中培养。描述菌落颜色、形态。挑取培养物，用Olympus生物显微镜观察菌丝、分生孢子形态，测量其大小。

1.5 病原菌的鉴定

黄瓜靶斑病致病菌的鉴定，主要根据被害状、培养性状和孢子及菌丝体的显微观察，并结合相应的真菌鉴定手册[3-4]。

2 结果与分析

2.1 黄瓜靶斑病的发病症状

大棚栽培的黄瓜中下部叶片上首先发病，以为害叶片为主，正反面均可受害。

2.1.1 发病初期 病害发生初期在叶片上形成黄色水浸状斑点，直径约1.0 mm。随着病害加重，病斑直径逐渐扩大，当扩展至1.5～2.0 mm时，叶片正面病斑略凹陷，病斑近圆形或稍不规则，有时因受叶脉所限而成多角形，病斑外围颜色稍深、呈黄褐色，中间颜色稍浅、呈淡黄色（如图1中A所示）。

2.1.2 发病中期 黄瓜靶斑病中期的发病症状如图1中B所示。发病中期病斑扩大为圆形或不规则形，病健界限明显，易穿孔，叶正面病斑粗糙不平，整体呈褐色，中央有一个灰白色的“靶心”，对光观察颜色变化明显，呈半透明状。

2.1.3 发病后期 发病后期，病斑成圆形或不规则形，病斑中央有一明显的“靶心”。发病严重时多个病斑连成片，成不规则状，整个叶片干枯致死。湿度大时病斑上可生有稀疏灰黑色的霉状物，成环状，为病菌的分生孢子梗和分生孢子（如图1中C所示）。

2.2 致病性鉴定

无论是活体接种还是离体接种，黄瓜叶片均可发病，产生与大棚内相似的症状。重新分离得到培养性状和形态特征与接种菌一致的分离物。

2.3 黄瓜靶斑病菌的培养性状

经单孢分离，得到纯化的病菌。黄瓜靶斑病的菌丝初期为白色，菌落呈圆形；培养3 d后随着菌丝的生长，菌丝颜色变暗，菌落逐渐向周围扩大；培养15 d后，菌落成浅灰褐色，平铺，质地致密，呈辐射状展开，边缘规则，气生菌丝灰白色或灰褐色、绒毛状，基生菌丝灰白色或浅褐色（如图2所示）。为了防止细菌污染，培养基中可加入少量链霉素，其对病菌生长无影响。

2.4 黄瓜靶斑病病菌分生孢子及菌丝体形态观察

2.4.1 菌丝形态 在PDA培养基上恒温培养的黄瓜靶斑病病菌，其菌丝淡褐色或灰黑色，具分枝和隔膜；分生孢子梗直或弯曲，浅褐色，不分枝，有分隔，基部有时膨大。

2.4.2 分生孢子形态 PDA培养基上25±1 ℃条件下培养的黄瓜靶斑病菌，其分生孢子顶生，多单生，浅褐色，倒棍棒形或圆筒形，顶端钝圆，直或稍弯曲，壁光滑，具1个至多个隔膜，孢子长度一般为34.42～316.92 μm，宽度为11.45～22.45 μm（如图3所示）。产孢适温为25±1 ℃；光照能促进菌丝的生长，但对孢子的产生有抑制作用；孢子的生长萌发需要一定的湿度。

3 结论与讨论

温室大棚内采集病样，经实验室内对病原菌进行分离培养、症状观察、培养性状和菌丝孢子形态鉴定及致病性测定，确定引起聊城地区黄瓜靶斑病的病原为Corynespora cassiicola，即半知菌亚门多主棒孢霉，该病原形态与前人研究[5-9]描述的黄瓜靶斑病（褐斑病）病原形态基本一致。

多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）自然侵染的寄主除了黄瓜之外，还能侵染番茄、茄子、烟草、红麻、一串红、一点红、橡胶树等[10-12]。人工接种还能侵染葫芦科、无患子科、大戟科、番木瓜科、锦葵科、菊科、茄科、旋花科、苋科、豆科、天南星科、木樨科和楝科共13科24种植物[13]。该病原菌存在寄主专化性和致病性分化。该病害虽然在我国20世纪60年代就有记载，但是进入21世纪初期，多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）侵染危害黄瓜的地域范围迅速扩展，危害程度日益严重，主要集中在我国北部及西北部省份，且主要发生在设施栽培的黄瓜上，是一个日趋严重的病害，值得关注。

黄瓜靶斑病在高温、高湿、昼夜温差大、结露时间长的环境易发病，危害严重，在生产实践中，应加强生态管理。为了控制该病害，使用化学药剂时，建议选用药剂混配来防治黄瓜靶斑病，如：4%四氟醚唑水乳剂+25%咪鲜胺水乳剂、40%稻瘟灵可湿性粉剂+25%咪鲜胺水乳剂和10%苯醚甲环唑微乳剂+25%咪鲜胺水乳剂，防效都在90%以上。在药液中加入适量的叶面肥效果更好，喷药重点是喷洒中、下部叶片[14-15]。

参考文献

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Abstract： In recent years， cucumber target spot disease occurred frequently in protected areas of Liaocheng area. The disease sample was separated for doing pathogenicity identification， incubation traits observation and morphological identification， especially spore morphology was observed carefully under a microscope. The results showed that， the symptom of cucumber target spot was caused by Corynespora cassiicola in Liaocheng area. The colonial morphology is circular with inerratic edge， in the color of white or taupe， flush system， compact and radiate. The mycelium is in the color of light brown or ash black， with branches and septa. The conidiophore is direct or bent， in the color of light brown， no branches， with septa. The conidium is acrogenesis， solitary， in the color of light brown， inverted clavate or cylindrical， direct or slightly curved， smooth， with one or more septa. The length of the conidiospore is 34.42～316.92 μm， the width is 11.45～22.45 μm.

Key words： cucumber； target spot； pathogens； morphological characteristics； Corynespora cassiicola