籼碎米蛋白质碱法提取工艺的优化

李玉珍 肖怀秋

(湖南化工职业技术学院制药与生物工程学院，湖南 株洲　412000)



籼碎米蛋白质碱法提取工艺的优化

李玉珍 肖怀秋

(湖南化工职业技术学院制药与生物工程学院，湖南 株洲412000)

为提高籼碎米蛋白质碱法提取效率，在Min-Run Res IV析因设计和爬陡坡试验的基础上，利用二次旋转中心组合响应面优化方法研究碱液浓度、籼碎米粒度、固液比对大米蛋白质提取的影响规律，并优化其提取工艺条件。结果表明，籼碎米蛋白质最优碱法提取工艺为碱液浓度0.09 mol/L，籼碎米粒度80目，固液比1∶13.5(g/mL)，碱提温度50 ℃，碱提时间120 min。该条件下蛋白质提取率为(82.25±2.53)%，大米蛋白质产物纯度为(91.68±1.26)%。

籼碎米；蛋白质；碱法提取

由于现有碾米技术的限制，在大米加工中约产生10%～15%的碎米[1]，特别是籼米，由于其细胞结构的特殊性，加工过程中碎米率更高[2]。近几年，随着人们对大米优质蛋白质资源研究的深入和对大米蛋白低过敏性的认同，大米蛋白质逐渐成为研究的新热点[3]。大米蛋白氨基酸配比合理，生物效价高，特别是赖氨酸含量是谷物中最高的，而且是唯一可免于过敏试验的谷物蛋白[4-5]，可作为婴幼儿食品的蛋白质营养基料[6]，具有良好的应用价值和市场前景。大米蛋白质主要为碱溶性的米谷蛋白，其在胚乳中与淀粉结合紧密，较难溶出。由于碱液能降低大米蛋白质与淀粉的结合作用力，使极性基团发生解离，并使大米蛋白质分子表面带负电荷，从而起到增溶作用，同时，也促使淀粉与蛋白质的有效分离，因此碱法提取适合于籼米及碎米中蛋白质的提取[7]。孙庆杰等[8]以0.09 mol/L NaOH为碱提溶剂进行了大米中碱溶性米谷蛋白的碱法提取，优化条件下蛋白质提取率和纯度分别为80.16%和90.10%；万娟等[9]以籼碎米为原料，采用传统碱法提取大米蛋白并优化了大米碱溶性米谷蛋白提取工艺，优化条件下蛋白提取率和纯度分别为77.3%和80.5%；王威等[10]以质量分数为0.35%的NaOH进行碱法提取大米蛋白，并对提取参数进行了优化分析，优化条件下蛋白质提取率为80.4%。目前来看，有部分学者进行了碱法提取米谷蛋白的试验研究，但局限于以单因素试验与正交试验进行提取工艺参数的优化，由于单因素与正交试验优化方法本身的不足，因素间交互作用考虑较少，而析因设计和响应面优化设计可以较好考虑各因素及因素间交互作用对响应值的影响。响应面优化是一种寻找多因素系统中最优条件的试验设计方法，主要用于受多个变量影响的复杂灰色体系的优化分析，可用于多变量非线性复杂体系的优化和考察交互作用影响，通过构建全局函数关系可实现快速建模和缩短优化时间并能提高应用可信度，二次旋转中心组合设计是响应面优化方法的一种，具有试验次数少、计算简便、回归系数间无相关性的优点，并可利用旋转性克服预测值方差对试验点在因子空间位置的依赖性[11]，广泛应用于试验条件的优化[12]。虽然碱提工艺会对大米蛋白氨基酸及提取设备造成一定的影响，但该法提取效率高、成本低且适宜于工业化生产[13]。因此，本试验以籼碎米为研究对象，以低浓度碱液作为提取溶剂，在析因设计和爬陡坡试验基础上采用响应面试验优化籼碎米蛋白质的碱法提取工艺，旨在为籼碎米蛋白质资源的综合利用提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料与试剂

籼碎米：市售；其它试剂均为分析纯。

1.1.2主要仪器设备

冷冻干燥仪：LABCONCO型，美国labconco公司；

冷冻离心机：HERMLE Z323K型，德国Hermle公司；

电热恒温水浴箱：DK-98-11A型，天津市泰斯特仪器有限公司；

紫外可见分光度计：752型，上海舜宇恒平仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1籼碎米常规组分的分析蛋白质测定采取凯氏定氮法、脂肪测定采取索氏抽提法、水分测定采取直接干燥法、灰分测定采取灼烧法进行含量测定[14]。

1.2.2籼碎米蛋白质碱法提取工艺

籼碎米→烘干(50 ℃恒温鼓风干燥24 h)→粉碎→碱提→过滤→离心(4 000 r/min，20 min)→上清液→调pH(用0.1 mol/L HCl调节pH至5.2)→离心(4 000 r/min，20 min)→沉淀→水洗→调节沉淀pH至中性(用0.1 mol/L NaOH调节pH至7.0左右)→离心(4 000 r/min，20 min)→冷冻干燥(-83 ℃预冷，-53 ℃下冷冻干燥48 h)→大米蛋白质

1.2.3籼碎米蛋白质碱法提取工艺的优化

(1) Min-Run Res IV析因设计：在预试验基础上拟考察碱液浓度、碱提温度、碱提时间、籼碎米粒度和固液比对籼碎米蛋白质提取的影响，因素编码水平与实际水平见表1。

表1　析因设计编码与实际水平

(2) 爬陡坡试验：由于响应面优化需在响应值最优邻域才能充分近似真实条件[15]，因此，各因素同时逼近其最优邻域时可表征各因素的真实影响。同时，基于析因设计方差分析与因素显著性分析设置因素变化方向及步长。

(3) 响应面优化：采用二次旋转中心组合响应面优化设计分析碱液浓度、籼碎米粒度和固液比对籼碎米蛋白质提取的影响。利用Design Expert 8.0.6进行三因素五水平旋转中心组合设计，共17次试验(中心点重复试验点为3个)。

1.2.4蛋白质提取率与蛋白质纯度的测定固体蛋白质含量采用凯氏定氮法测定(转换系数为5.95[13])，溶液蛋白质含量采用考马氏亮兰法[16]测定。蛋白质提取率与蛋白质纯度分别按式(1)和(2)计算：

(1)

(2)

2　结果与分析

2.1籼碎米常规组分分析结果

对籼碎米的主要组分含量进行了测定，结果见表2。

表2　籼碎米主要常规成分含量

2.2Min-Run Res IV析因设计

碱液浓度、碱提温度、碱提时间、籼碎米粒度和固液比对籼碎米蛋白质提取率的影响见表3。

利用Design expert 8.0.6对表3进行线性回归拟合得到回归方程为：

y=27.02+2.65X1+0.90X2+1.40X3+7.35X4+15.67X5。

(3)

对表3数据进行方差分析与因素显著性分析，结果见表4。

由表4可知，模型显著性分析为显著(P<0.05)，模型信噪比(signal to noise ratio，SNR)为6.795(>4)，说明模型精度符合要求。当模型存在因素间交互作用时，不能用回归系数绝对值进行主效因素的筛选，宜用因子百分贡献率进行比较[17]，其中X1、X4和X5百分贡献率分别为1.54%，11.88%，50.70%，三因素累积贡献率之和为64.12%，为主效因子且均为正效应，应进一步增加这些因素的取值水平。

表3　析因设计因素水平与结果

表4　析因设计方差分析与因素显著性分析†

†**表示影响极显著(P<0.01)；*表示影响显著(P<0.05)；ns表示影响不显著(P>0.05)。

2.3爬陡坡试验

基于析因设计结果设定因素爬坡方向及步长，见表5。

由表5可知，邻优区域在2号，提取率最高。因此，以该条件为中心组合设计中心点。

2.4响应面优化结果与分析

对碱液浓度、籼碎米粒度和固液比进行中心组合响应面优化设计，因素编码与实际水平见表6。

响应面优化试验方案与结果见表7。为减少试验误差，试验随机安排。

表5　爬陡坡试验设计与结果†

†ΔX1=+0.02 mol/L；ΔX2=20目；ΔX3=1∶2(g/mL)。

2.4.1模型序贯分析与数学模型的构建模型序贯分析(model sequential analysis，MSA)是响应面模型构建的重要依据，各阶模型序贯分析结果见表8。

由表8可知，一阶线性模型显著性分析为不显著(P>0.05)，失拟项极显著(P<0.01)。失拟项显著表示此阶数值模型数据拟合效果较差，需用更高阶模型对数据进行拟合[18]；二因素交互关系模型失拟项极显著(P<0.01)，也不宜对数据进行拟合；二阶模型显著性分析为极显著(P<0.01)，R2= 0.960 7，Adj.R2=0.910 3，失拟项不显著(P>0.05)，因此，用二阶模型对数据进行拟合其精度是符合要求的。三阶模型的模型显著性分析和失拟项显著性分析均不显著(P>0.05)，不宜对数据进行拟合，而且所拟合回归方程相对复杂，应用不便，因此，本试验宜用二阶模型对数据进行回归拟合。拟合回归方程为：

表6　响应面优化因素编码与实际水平

表7　响应面优化设计与试验结果

表8　响应面模型构建序贯分析†

†**表示影响极显著(P<0.01)；*表示影响显著(P <0.05)；ns表示影响不显著(P >0.05)。

(4)

2.4.2模型方差分析与回归分析从模型方差分析和回归分析结果(表9)可看出，回归模型极显著(P<0.01)，R2=0.960 7，Adj.R2= 0.910 3，说明该模型能解释总变异的91.03%。模型失拟项不显著(P>0.5)表明用该模型对数据进行预测不会造成数值失真。变异系数(CV)是衡量模型精密度和可靠性的重要评价指标，数值越小，模型越可靠[18]，模型CV为8.53%。模型SNR为14.107(>4)，说明该模型可很好的应用于数据分析和结果预测。

2.4.3模型降维分析(交互作用分析)当其它因素为零水平时，可观察某两个因素对响应值的影响并得到交互作用项的响应面图和等高线图(图1)。响应曲面坡度比较平缓时表明交互作用对响应值影响不大，若非常陡，则表明交互作用对响应值影响显著。等高线图呈椭圆形且排列致密说明交互作用项对响应值影响显著，若呈圆形则此时交互效应可忽略[9]。由图1可知，交互作用项X1X2和X1X3对响应值影响较弱，而交互项X2X3影响则较强。

表9　回归模型方差分析与回归分析†

†**表示影响极显著(P <0.01)；*表示影响显著(P<0.05)；ns表示影响不显著(P>0.05)；模型确定系数R2=0.960 7，模型调整确定系数Adj.R2=0.910 3。

图1　因素交互作用响应曲面图和等高线图

2.4.4模型最优解及验证实验响应变量分别对各自变量求偏导并令结果为零，联立得到三元一次方程组，解逆矩阵得到响应面函数驻点(最优解)，即X1=0.085 8 mol/L，X2=78.8目，X3=1∶13.32(g/mL)。为操作方便，将结果修约为碱液浓度0.09 mol/L，籼碎米粒度80目，固液比为1∶13.5(g/mL)，优化条件下大米蛋白质提取率为(82.25±2.53)%(n=3)，比表7中第2组试验结果稍低，可能是试验误差造成的，比模型预测值84.655 1%稍低，偏差为-0.48%。制备得到的大米蛋白纯度为(91.68±1.26)%(n=3)。

3　结论

因大米蛋白碱提效率受碱液浓度、碱提温度、碱提时间、籼碎米粒度和固液比等多因素综合影响，是一个复杂的灰色体系，为解析各因素的影响规律，本试验在析因设计和爬陡坡试验的基础上应用二次旋转中心组合响应面优化方法研究了碱液浓度、籼碎米粒度和固液比的影响规律并获得优化条件，即碱液浓度0.09 mol/L，籼碎米粒度80目，固液比1∶13.5(g/mL)，碱提温度50 ℃，碱提时间120 min。优化条件下大米蛋白质提取率和纯度分别为82.25%和91.68%。结果表明，析因设计与响应面优化技术联用可很好用于籼碎米蛋白质碱法提取工艺的优化分析。

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Optimizating the alkaline extraction technology of broken long-grain rice protein

LI Yu-ZhenXIAOHuai-Qiu

(PharmaceuticalandBioengineeringSchool,HunanVocationalTechnicalCollegeofChemicalandIndustrialTechnology,Zhuzhou,Hunan412000,China)

To improve the efficiency of protein extraction from broken long-grain rice, a quadratic rotatable central composite response surface methodology (qrCCD-RSM) was utilized to investigate the affecting mechanism of alkali concentrations, broken long-grain rice particle sizes and solid-liquid ratios (SLR), based on the results of Min-Run Res IV factorial design and steep accent experiments (SAE). The optimal extraction condition was obtained, i.e. 80 mesh of broken long-grain rice was used to extrat proteins, soluting in 0.09 mol/L of NaOH buffer, with the SLR 1 g∶13.5 mL at 50 ℃ for 120 min. Under this optimized condition, the protein extraction rate and its purity was found to be (82.25±2.53)% and (91.68±1.26)%, respectively.

broken long-grain rice; protein; alkaline extraction

湖南省高校科研项目(编号：12C1049)；国家自然科学基金(编号：31050012)；湖南化工职业技术学院院级课题(编号：HNHY2015002)

李玉珍，女，湖南化工职业技术学院讲师，硕士。

肖怀秋(1981—)，男，湖南化工职业技术学院副教授，硕士。E-mail:xiaohuaiqiu@163.com

2015—12—06

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.042