补肾解毒方影响辐射小鼠TLR4信号通路下游炎性因子表达的机制研究*

李延晖　张　蓉　杨云霜　杨利丹

中国人民解放军火箭军总医院(北京100088)



补肾解毒方影响辐射小鼠TLR4信号通路下游炎性因子表达的机制研究*

李延晖张蓉△杨云霜杨利丹

中国人民解放军火箭军总医院(北京100088)

目的：观察补肾解毒方对60Co γ射线辐射后小鼠TLR4(Toll like receptor-4)信号转导通路下游相关炎性因子表达的影响并探讨其作用机制。方法：将背景为C57BL/10J的小鼠(TLR4+/+)完全随机分为TLR4+/+空白对照组、TLR4+/+辐射模型组、TLR4+/+中药组，同等背景下TLR4基因敲除小鼠(TLR4-/-)完全随机分为TLR4-/-空白对照组、TLR4-/-辐射模型组、TLR4-/-中药组。除TLR4+/+空白对照组、TLR4-/-空白对照组外，其余四组小鼠均一次性接受60Co γ射线6Gy剂量的全身照射，观察存活情况；记录各组小鼠辐射后第1、14、30天脾脏IL-6、IL-10、IL-17、IL-18、IFN-γ、TGF-β1的数值。结果：TLR4+/+辐射模型组小鼠的脾脏IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ在辐射后第1d、第14d与空白对照组相比均有不同程度的增加，而TLR4+/+辐射模型组小鼠的IL-10和TGF-β1与空白对照组相比则有明显减少。TLR4+/+中药组小鼠的IL-6和IL-10在辐射后第1d均较模型组明显恢复，IL-17、IL-18在第14d部分恢复，TGF-β1在第14d明显恢复。TLR4-/-辐射模型组小鼠的各炎性细胞因子相对空白对照组亦有不同程度的变化，但TLR4-/-中药组小鼠的炎性细胞因子表达相对辐射模型组无明显统计学意义。结论：补肾解毒方通过TLR4信号途径能显著减轻核辐射损伤，影响各炎性细胞因子的表达。

主题词辐射炎性因子信号通路

ABSTRACT

Objective: To observe the effect of Bushen Jiedu decoction on the expression of inflammatory factors in the downstream of TLR4 (like receptor-4 Toll) signal transduction pathway in mice after radiation of 60Co-γray and to explore its mechanism. Methods: The C57BL/ 10J background mice (TLR4+/+) were randomly divided into TLR4+/+blank control group, TLR4+/+radiation model group, TLR4+/+TCM group,under the same background TLR4 gene knockout mice (TLR4-/-) were randomly divided into TLR4-/-blank control group, TLR4-/-radiation model group, TLR4-/-TCM group. In addition to the two control groups, the rest of the four groups of mice were one-time accepted 6 Gy 60Co γ-ray dose total body irradiation. The survival of mice after radiation in each group was observed, and the values of IL-6、IL-10、IL-17、IL-18、IFN-γ、TGF-β1 in the spleen at 1 , 14and 30days were recorded.Results:IL-6, IL-17, IL-18, IFN-γof the TLR4+/+radiation model group mice increased in different degrees(P<0.01) and IL-10和TGF-β1 significantly decreased compared with the blank control group at 1 , 14and 30days after irradiation. Compared with the model group, IL-6 and IL-10 of the TLR4+/+TCM group restored obviously at 1 day, IL-17、IL-18 restored partially and TGF-β1 restored obviousl at 14 days. Inflammatory cytokines of the TLR4-/-radiation model group were changed in different degree compared with the blank control group. Inflammatory cytokines had no statistical significance between the TLR4-/-TCM group and the radiation model group. Conclusion: Bushen Jiedu decoction can significantly reduce the radiation injury and affect the expression of inflammatory cytokines through the TLR4 signal pathway. It has an ideal radiation protection function.

随着科学技术的发展，核能的应用越来越广泛。在造福人类的同时，核能也给人类的健康与安全带来严峻挑战。各种核设施产生的辐射及其泄露的放射性物质，严重影响到人类的健康与生命。辐射导致的多脏器放射性损伤至今仍是临床上亟待解决的问题[1]。因此，探索辐射损伤相关分子机制、开发辐射防护药物，对于国防和民用都具有不可忽略的意义[2]。中药复方的优点是低毒、高效、防治结合，这也使其成为新型核辐射防护剂的研究热点，但中药复方防护核辐射损伤的机制及作用靶点尚不明确，限制了其推广及应用[3]。本研究组前期研究[4]结果显示，六味地黄丸能够显著降低辐射损伤并保护重要脏器。我们将六味地黄丸进行优化组合，在原方基础上熟地黄用量减半，加冬虫夏草、白花蛇舌草形成了补肾解毒方，拟从TLR4信号转导途径对补肾解毒方抗辐射作用机制及靶点进行研究。

1材料1.1动物SPF级健康雄性小鼠[合格证号SCXK(苏)2010-0001]276只，由南京大学-南京生物医药研究院提供。其中138只C57BL/10SCNJ TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠20±2g为南京大学—南京生物医药研究院直接提供，另外138只C57BL/10J (TLR4+/+)小鼠繁育出的子代小鼠20±2g为南京大学模式动物研究所从美国JAX公司代购的。

1.2药品及试剂补肾解毒方组成：熟地黄、山药、泽泻、茯苓、牡丹皮、白花蛇舌草各10g，山萸肉12g，冬虫夏草3g，由康仁堂药业有限公司配置成中药颗粒，中药颗粒加无菌水配成浓度为1.38g/ml的混合液。

1.3仪器电子天平(型号00000246)；γ辐照装置(北京师范大学化学学院)。

2实验方法2.1模型建立及分组采用随机数字表法将138只TLR4+/+小鼠分为空白对照组(18只)、辐射模型组(60只)、中药组(60只)。138只TLR4-/-小鼠分为空白对照组(18只)、辐射模型组(60只)、中药组(60只)。除TLR4-/-和TLR4+/+空白对照组外，其余各组均一次性接受γ辐照装置放射的60Co γ射线，由于实验动物品系的不同，在前期研究[4]基础上分别给予小鼠5Gy、6Gy、7Gy辐射剂量进行预实验处理，发现6Gy是本实验最为合适的剂量，总时长5min，剂量率1.2Gy/min。

2.2给药方法对所有实验小鼠适应性喂养7d后，每天08:00 TLR4-/-和TLR4+/+小鼠空白对照组、辐射模型组给予0.2ml生理盐水， TLR4-/-和TLR4+/+小鼠中药组给予补肾解毒方13.50g/(kg·d)，连续灌胃10d，第11天进行1次性60Co γ射线照射，照射后第2天开始继续灌胃14d。

2.3观察指标及方法实验期间观察小鼠一般状况，包括精神、毛色、体重、饮食、活动等情况。TLR4-/-和TLR4+/+小鼠空白对照组分别于辐射后第1、14、30天各取材6只； TLR4-/-和TLR4+/+小鼠辐射模型组、中药组分别于辐射后第1天取材7只，第14天取材每组存活小鼠数量的1/2，第30天取材每组剩余存活的小鼠。处死小鼠后，取脾脏制作脾脏单细胞悬液，Elisa法测定各组小鼠炎性细胞因子。

2.4统计学方法采用SPSS 19.0统计软件进行统计学处理，计量资料采用平均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05作为有统计学差异。

3结果3.1一般情况观察TLR4-/-和TLR4+/+小鼠空白对照组在整个实验阶段一般情况良好，毛色光亮，体重、饮食均正常。其余各组小鼠辐射后第1天均出现狂躁、易惊恐不安、饮食下降、体重减轻等情况；第2天后开始出现精神萎靡，毛色晦暗甚至片状脱毛，饮食量下降明显，体重普遍减轻。对自然死亡的小鼠进行解剖后发现，普遍存在出血现象，且部分小鼠出现肝肿大、肝脾小结节、腹水，肝脏、肾脏表面有成片点状脓肿，胃黏膜损伤，肠梗阻、肠胀气，还发现个别小鼠出现甲状腺肿大、生殖器瘀血等现象。

3.2各组小鼠死亡情况辐射前TLR4+/+小鼠辐射模型组小鼠57只，中药组55只；TLR4-/-小鼠模型组、中药组各58只。TLR4+/+小鼠辐射模型组在辐射后第2天出现死亡，至第14天共死亡41只，中药组辐射后第7天出现死亡小鼠，至第10天共死亡15只；TLR4-/-小鼠辐射模型组辐射后第5天出现死亡，至第13天共死亡39只，中药组在辐射后第4天出现死亡小鼠，至第13天共死亡38只。

3.3各组小鼠炎性细胞因子表达情况TLR4+/+辐射模型组小鼠的脾脏IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ在辐射后第1d、第14d与空白对照组相比均有不同程度的增加(P<0.01)，而TLR4+/+辐射模型组小鼠的IL-10和TGF-β1与空白对照组相比则有明显减少(P<0.01)。TLR4+/+中药组小鼠的IL-6和IL-10在辐射后第1d均较模型组明显恢复(P<0.01)，IL-17、IL-18在第14d部分恢复(P<0.05)，TGF-β1在第14d明显恢复(P<0.01)。TLR4-/-辐射模型组小鼠的各炎性细胞因子相对空白对照组亦有不同程度的变化，但TLR4-/-中药组小鼠的炎性细胞因子表达相对辐射模型组无明显统计学意义，见表1-6。

表1　辐射后各组小鼠IL-6的表达变化

表2　辐射后各组小鼠IL-10的表达变化

表3　辐射后各组小鼠IL-17的表达变化

表4　辐射后各组小鼠IL-18的表达变化

表5　辐射后各组小鼠IFN-γ的表达变化

表6　辐射后各组小鼠TGF-β1的表达变化

4讨论既往研究表明，电离辐射可导致多个细胞和组织损伤，诱导机体产生一系列特异性和非特异性免疫应答以及炎症反应[5]。其中，近70%的伤害是间接引起强烈的氧化应激反应[6]。而中医理论认为，高能射线是一种火邪、热毒，其毒邪兼具火热邪气的特点，热毒蕴于体内，充斥三焦[7]。补肾解毒方是由滋阴补肾代表方六味地黄丸优化组合而来，在原方基础上熟地用量减至10g，加冬虫夏草3g、白花蛇舌草10g，在滋阴补肾的同时亦有补益气血、固护正气、清热解毒之效，达到标本同治的目的。

有研究显示TLR4信号转导通路是辐射免疫损伤的重要途径，TLR4信号通路受到基因的干预，通过观察该通路下游炎性因子的表达变化能够反应补肾解毒方在辐射损伤中起到的炎症防护作用[8]。既往研究表明，电离辐射会引起机体炎性因子IL-1β升高,产生氧化应激反应[2]，且IL-1β是放射性脑损伤的重要炎症介质之一[9]。IL-6、IL-17、TGF-β1是放射性肺损伤的炎性表达因子，其中，IL-17通过抑制 p53蛋白的表达，从而抑制辐射引发的细胞凋亡[10]。IFN-γ和IL-10在蛋白 ZO-1上的表达分别促进和减少肠上皮细胞凋亡[11]。IL-18的水平升高亦能反映辐射剂量和辐射损伤的严重程度[12]。

本研究结果显示，TLR4+/+辐射模型组小鼠的炎性细胞因子在辐射后第1天、第14天与空白对照组相比均有不同程度的变化。TLR4+/+中药组小鼠的IL-6和IL-10在辐射后第1天均较模型组明显恢复，IL-17、IL-18 、TGF-β1在第14d部分或明显恢复。但TLR4-/-中药组小鼠的炎性细胞因子表达相对辐射模型组无明显统计学意义。此研究结果表明，TLR4通路在补肾解毒方对辐射小鼠辐射防护中起到的信号转导作用确切，补肾解毒方可通过TLR4信号转导通路发挥辐射防护作用，延长存活时间，抑制辐射损伤导致的氧化应激反应，及早清除系统无法修复的组织、细胞，保持基因组的稳定性，从而发挥免疫抑制作用，这为今后我们进一步优化补肾解毒方等辐射防护剂提供一种新的思路及理论基础。

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(收稿2016-03-17；修回2016-05-20)

Mechanism study on the expression of inflammatory factors in the downstream of TLR4 signaling pathway in mice with Bushen Jiedu decoction

Chinese People’s Liberation Army Rocket Army General Hospital(Beijing 100088)

Li Yanhui Zhang Rong Yang Yunshuang et al

RadiationInflammatory factorSignaling pathway

*国家自然科学基金资助项目(81202637)

R114.1

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.09.071