黄瓜枯萎病拮抗菌GK-6抗菌物质的产生条件

张雪辉，唐 蕊，魏洪亮

（1.邢台学院化学工程与生物技术学院 河北邢台 054001； 2.保定市农业局 河北保定 071000）

黄瓜枯萎病是由半知菌亚门尖镰孢菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinumOwen.）所引起的一种在全球范围内传播的土传真菌病害，该病一般可造成黄瓜产量下降10%～30%，严重时可致使黄瓜产量下降80%～90%，对黄瓜产量有很大影响[1-2]。近年来随着黄瓜种植面积的增长，由连作重茬而引起的黄瓜枯萎病日渐严重。在实际生产中除了选用抗病品种、结合轮作倒茬和嫁接等栽培管理之外，使用药剂防治是黄瓜枯萎病防治的重要方法，但当前因缺乏安全有效的药剂，极易造成农药残留，从而危害人畜健康及环境安全。生物防治是目前研究克服土传病害的重要方向，主要利用拮抗微生物及其产生的代谢物进行植物病害的预防与治理，又以其安全和高效的特点日益引起人们的关注[3-4]。笔者以从多年种植黄瓜的土壤中分离得到的对黄瓜枯萎病拮抗作用较好的菌株GK-6为试验材料，通过试验找出GK-6菌株抗菌代谢物产生的最佳培养条件，为开发新型生物药剂提供理论依据，进而为黄瓜的绿色生产保驾护航。

1 材料与方法

1.1 材料

拮抗菌GK-6、黄瓜枯萎病菌菌株均由邢台学院微生物实验室提供。

培养基为马铃薯培养基（PDA）、牛肉膏蛋白胨培养基（LB）、LB液体培养基。

1.2 方法

1.2.1 母液制备 将保存的菌种GK-6转接到LB培养基平板上活化，24h后接种于100mL液体培养基中，然后在28℃、170 rpm振荡条件下培养24 h,经血球计数板计数得到密度为4.2×108cfu·mL-1的悬浮液，置于4℃冰箱保存，作为母液备用[5]。

1.2.2 培养时间对发酵液抑菌活性的影响 将母液按1∶20的比例接种于盛有100 mL LB液体培养基的三角瓶中，并分为7组，培养条件设置为28℃下170 rpm振荡培养，之后分别在8、16、24、32、40、48、56 h 时取出离心，无菌过滤，保留滤液。将牛津杯放置于混有黄瓜枯萎病菌的PDA平板上，每牛津杯中加入20μL滤液，每处理10次重复，在28℃培养48 h后测量抑菌圈直径[6-7]。

1.2.3 培养基初始pH值对发酵液抑菌活性的影响 将100 mL LB液体培养基用1 mol·L-1HCl或1 mol·L-1NaOH 调节 pH 值至 5、6、7、8、9、10 标记后灭菌。每瓶加入5mL母液，在摇床上28℃、170rpm条件下振荡培养48 h，取出离心过滤，测定滤液抑菌活性，方法同1.2.2。

1.2.4 培养温度对发酵液抑菌活性的影响 将5 mL母液分别加入到盛有100 mL LB液体培养基的三角瓶中，分别在 24、28、30、32、36 ℃和 170 rpm条件下培养48 h，然后取出离心过滤，测定滤液抑菌活性，方法同1.2.2。

1.2.5 接种量对发酵液抑菌活性的影响 将母液分别以 0、0.5、1、3、5、7、10 mL 的接种量加到100 mL的LB液体培养基中，在28℃、170 rpm条件下培养48 h，然后取出离心过滤，测定滤液抑菌活性，方法同1.2.2。

2 结果与分析

2.1 培养时间对菌株GK-6发酵液抑菌活性的影响

从图1可看出，菌株GK-6发酵液抑菌活性最初随着培养时间的延长逐渐提高，培养到40 h时抑菌圈直径达到最大值28 mm，随后抑菌活性则开始下降。结果表明，其最佳发酵时间应为40 h。

图1 培养时间对菌株GK-6发酵液抑菌活性的影响

2.2 培养基初始pH值对菌株GK-6发酵液抑菌活性的影响

由图2可知，培养基的初始pH对菌株GK-6的抑菌活性影响较大。当pH处于5～7之间时随着pH的增大，抑菌活性会明显增强，在pH=7时抑菌圈直径达到了最大值27.9 mm，pH=8时略有下降，抑菌圈直径为27.0 mm，当pH处于8～10之间时，抑菌活性明显下降。结果表明，pH 7～8的弱碱性培养条件是菌株GK-6抗菌物质产生的较适条件。

图2 初始pH值对菌株GK-6发酵液抑菌活性的影响

2.3 培养温度对菌株GK-6发酵液抑菌活性的影响

由图3可以看出，随着培养温度的增加，GK-6菌株抑菌活性逐渐增强，温度到达30℃时抑菌活性最高，达到28.1 mm，之后抑菌活性会随着温度的升高而逐渐下降。结果表明，30℃是其抗菌物质产生的最佳温度。

图3 培养温度对菌株GK-6发酵液抑菌活性的影响

2.4 接种量对菌株GK-6发酵液抑菌活性的影响

从图4可知，不同的接种量对GK-6抑菌活性影响较大，最初随着接种量的增加,GK-6发酵液的抑菌活性增高,当接种量为5 mL时GK-6的抑菌活性达到最高,抑菌圈直径达28.8 mm,而后随着接种量增大,抑菌活性反而降低。结果表明，接种量为5 mL，即接种量为5%（φ，下同）时其抑菌活性最强。究开发阶段。

图4 接种量对菌株GK-6发酵液抑菌活性的影响

本研究结果表明拮抗菌GK-6产生抗菌物质的最佳培养条件是培养液初始pH 7～8，接种比例为5%时，在30℃，170 rmp振荡培养40 h。虽然该结果仅仅是通过室内摇瓶培养而得到的，不能直接转化为实际工业化生产的参考依据，但仍具有一定的参考价值，为其商品化开发奠定了一定的基础[10]。为充分发挥生防菌的潜力做好准备，对GK-6的特性及其有效使用剂量、使用时间等问题还需进一步研究。

3 讨论与结论

连茬和重茬使得黄瓜枯萎病发生日趋严重，特别是保护地栽培表现尤为明显，成为黄瓜生产中的毁灭性病害。培育和应用抗病品种是防治此病害最经济有效的措施。但由于枯萎病抗源材料不足，传统育种方法周期长，抗性品种有限。虽然采用传统育种方法和细胞工程、基因工程等现代生物技术相结合以选育抗枯萎病新品种在西瓜抗病育种取得了重大突破，但在黄瓜上还需时日。因此，栽培上绝大部分仍是感病品种[8]。在追求食品品质的今天，随着现代农业的发展，生物源农药的研发成为热点。国内外针对黄瓜枯萎病展开的生防菌研究越来越热，目前在生产上应用的主要有真菌、细菌、放线菌等，其应用主要是活菌制剂和抗生素两种。世界上成功应用的有芬兰的一种活体制剂My-costop和我国的由细黄链霉菌制成的“5406”[9]。目前生防菌的研究大多数处于待研