肉苁蓉苯乙醇总苷对血小板衍生生长因子诱导的肝星状细胞增殖的影响及机制

由淑萍，赵　军，马　龙，张石蕾，刘　涛

(1. 新疆医科大学公共卫生学院，新疆 乌鲁木齐　830011;2.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐　830004)

肉苁蓉苯乙醇总苷对血小板衍生生长因子诱导的肝星状细胞增殖的影响及机制

由淑萍1，赵军2，马龙1，张石蕾1，刘涛1

(1. 新疆医科大学公共卫生学院，新疆 乌鲁木齐830011;2.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐830004)

目的探讨肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)抑制血小板衍生生长因子-BB(rrPDGF-BB)介导的大鼠肝星状细胞(HSC)增殖活化作用及对PDGF/ERK1/2信号通路表达的影响。方法培养HSC细胞，体外给予不同浓度(0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00和500.00 mg·L-1)的CPhGs测定半数抑制率(IC50)，选取25、50、75、100 mg·L-1的CPhGs，rrPDGF-BB刺激后，通过四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测细胞的增殖；采用荧光定量PCR(RT-PCR)检测ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun和Collagen I mRNA的表达；进一步采用Western blot 法检测CPhGs对PDGF/ERK1/2通路中ERK1/2、P-ERK1/2和Collagen I蛋白的表达。结果(50～100)mg·L-1的CPhGs可以抑制rrPDGF-BB诱导的HSC的增殖(P<0.05)；(25～100)mg·L-1剂量组的CPhGs均可抑制ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun和Collagen Ⅰ mRNA水平的表达，并且明显抑制ERK1/2、P-ERK1/2和Collagen Ⅰ通路蛋白的表达。结论CPhGs的抗肝纤维化作用可能与其阻断PDGF/ERK1/2通路进而阻断HSC的活化、增殖有关。

肉苁蓉苯乙醇总苷; 血小板衍生生长因子; 肝星状细胞; 肝纤维化;细胞增殖;信号通路;作用机制

肝纤维化是慢性肝病发展为晚期肝硬化的中间环节，由细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成与降解失衡所致，已成为肝病死亡的主要原因[1]。纤维化ECM产生于肌成纤维细胞(myofibroblast，MFB)，MFB主要来源于活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)[2-3]；因此，抑制HSC的激活，减少其增殖、活化是有效阻断肝纤维化发生、发展进程的重要途径，对预防肝硬化[4]、逆转肝纤维化的病程[5]具有重要的意义。肉苁蓉(Cistanche)是列当科肉苁蓉属，一种在沙漠树木梭梭根部的寄生植物，中国传统的名贵中药材，其主要成分中苯乙醇总苷(phenylethanol glycosides from cistanche tubulosa，CPhGs)[6]系发挥药效的主要物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种生物活性。前期研究显示，CPhGs对牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)所致肝纤维化大鼠具有一定的防治作用[7-8]，血小板衍生生长因子(PDGF)-BB已被证实在刺激HSC生长和相关细胞间信号传递方面较为重要，本研究旨在观察CPhGs在rrPDGF-BB诱导的HSC细胞增殖中的作用及其对ERK信号转导通路的影响。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器肉苁蓉苯乙醇总苷：管花肉苁蓉取自新疆吐鲁番地区，物种标本凭证存放于新疆省中药研究所，CPhGs由新疆维吾尔自治区药物研究所植物化学室提取纯化，纯度为70%，以含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养液配成不同浓度的混悬液，经0.22 μm滤器过滤后使用；大鼠HSC购自武汉Procell生物科技有限公司；Recombinant rat PDGF-BB购自 Peprotech公司；ERK1/2、α-SMA、β-actin引物委托上海生工生物工程服务有限公司设计，经Genbank核实后合成；cDNA反转录试剂盒购自Thermo scientific公司；荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)试剂盒购自QIAGEN GmbH公司；β-actin单克隆抗体购自武汉Proteintech公司；p44/42 MAPK(ERK1/2) Antibody和Phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2) Antibody购自Cell signaling technology公司；Collagen Ⅰ(ab34710)抗体购自Abcam公司；碱性磷酸酶标记的二抗购自于美国Invitrogen公司；RIPA裂解液购自于Thermo Fisher Scientific公司。

1.2HSC的培养和传代和半数抑制率(IC50)HSC常规复苏后，用含10%的胎牛血清的DMEM(高糖)完全培养液，在37℃、5% CO2及饱和湿度下培养；当细胞呈单层致密状时，常规胰蛋白酶消化传代，24 h换液，72 h再传代；实验选用对数生长期细胞，以5×104·L-1接种于96孔板，24 h后换液，加入不同浓度组(0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00和500.00 mg·L-1)的CPhGs，每组4个复孔，作用48 h，MTT法于酶标仪490 nm测定吸光度A值并取均数，计算IC50。

Tab 1　Composition of RT-PCR primer sequences

1.3MTT法检测CPhGs对rrPDGF-BB刺激HSC增殖影响实验分组为空白对照组、rrPDGF-BB刺激组、PDGF-BB+不同终浓度(25、50、75、100 mg·L-1)CPhGs给药组。另设与试验平行不加细胞只加DMEM培养液的空白组。rrPDGF-BB的终浓度为10 ng·L-1，每组4个复孔，分别在加药后24、48、72 h后进行MTT法检测HSC的增殖抑制作用。抑制率/%=[(A模型组-A空白组)-(A用药组-A空白组)]/(A模型组-A空白组)×100%。

1.4CPhGs对rrPDGF-BB刺激的HSC ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen Ⅰ mRNA表达的影响收集各组细胞，提取细胞总RNA，cDNA合成参照公司的逆转录试剂盒合成。引物的设计及合成：由上海生工生物有限公司采用引物设计软件Batch Primer 3设计，经Genbank核实后合成。引物序列见Tab 1。

反应条件：94℃变性3 min，变性94℃ 30 s，退火30 s，延伸72℃ 45 s，循环30次，终末延伸72℃ 10 min，其他步骤按说明书进行操作。以β-actin为内参，以目的基因与β-actin的比值表示目的基因mRNA的相对表达量(2-ΔΔCt)。

1.5CPhGs对rrPDGF-BB刺激的HSC p44/42 MAPK(ERK1/2)、Phospho-p44/42 MAPK(P-ERK1/2)和Collagen Ⅰ蛋白表达的影响细胞分组同上。RIPA裂解液裂解细胞，4℃ 12 000×g离心收集上清液，BCA法测定蛋白含量，加4×loading buffer煮沸蛋白，上样蛋白量30 μg，制备10%的SDS-PAGE凝胶进行电泳。100 V恒压转膜70～100 min，用10%脱脂奶粉封闭1 h。一抗为兔抗p44/42 MAPK(ERK1/2) antibody和Phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2) antibody(1 ∶1 000)及β-actin(1 ∶5 000)单克隆抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的抗兔抗体(InvitrogenTM)，显色剂显影，GEL DOC XR凝胶成像系统分析结果。

2　结果

2.1CPhGs对HSC的IC50由Fig 1可知，随着CPhGs药物浓度的增加，HSC的抑制率逐渐增加，CPhGs在500 mg·L-1浓度时，抑制率达到73.4%，采用Probit分析，计算CPhGs药物的IC50为119.125 mg·L-1。

Fig 1　Effects of different concentrations of CPhGs on proliferative activity of HSC cells in 48 h

2.2不同浓度、不同时间CPhGs对rrPDGF-BB 诱导HSC细胞的增殖抑制作用与正常对照组比较，rrPDGF-BB(10 ng·L-1)组的HSC细胞明显增加，其中以48 h增殖最为明显(P<0.01)，提示模型构建成功；与rrPDGF-BB组比较，除25 mg·L-1的CPhGs对HSC的抑制作用在24 h及48 h作用不明显以外，余CPhGs组均能不同程度地抑制rrPDGF-BB诱导的HSC的增殖，差异有统计学意义(P<0.05)，其中rrPDGF-BB+CPhGs 100 mg·L-1剂量组的抑制率最高达47.20%；以抑制率表现最佳的CPhGs 100 mg·L-1进行药物作用时间的考察，CPhGs

Tab 2　Inhibition effects of CPhGs with different doses on rrPDGF-BB induced HSC ±s)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsPDGF-BB group

作用于细胞48 h较24 h时抑制率明显增加，但48 h后抑制率增加逐渐平缓，72 h时抑制率最佳。说明CPhGs发挥作用的最佳时间为rrPDGF-BB 刺激 HSC细胞48 h，后续时间，CPhGs的抑制率增加趋于稳定，见Tab 2。

2.3CPhGs对rrPDGF-BB刺激的HSC ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen Ⅰ mRNA表达的影响RT-PCR检测ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun、Collagen Ⅰ及β-actin基因表达，25～100 mg·L-1浓度的CPhGs均可不同程度地下调细胞ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun、Collagen I的mRNA表达，结果显示：与正常对照组比较，在rrPDGF-BB组ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun和Collagen Ⅰ mRNA的表达水平(P<0.05)明显增高；与rrPDGF-BB组比较，CPhGs不同浓度药物组的ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun和Collagen Ⅰ mRNA表达强度均有所下降(P<0.05)，差异有统计学意义(Fig 2)。

Fig 2　Effects of CPhGs on expressions of ERK1/2, α-SMA, c-fos, c-jun and Collagen Ⅰ in HSC(RT-PCR assay)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsrrPDGF-BB group

2.4CPhGs对rrPDGF-BB刺激的HSC ERK1/2、p-ERK1/2和Collagen Ⅰ蛋白表达的影响如Fig 3所示，rrPDGF-BB刺激的HSC ERK1/2、p-ERK1/2和Collagen Ⅰ蛋白表达较正常组明显增加，CPhGs(25、50、75、100 mg·L-1)给药组均可不同程度地抑制rrPDGF-BB诱导的HSC ERK1/2、p-ERK1/2和Collagen Ⅰ蛋白表达，其中以CPhGs100 mg·L-1给药组作用效果最为明显。

3　讨论

PDGF主要源于血液中的血小板、肝窦内皮细胞、HSC、单核细胞、肝库普弗细胞等[9]。PDGF 包括-AA,-AB,-BB 3种亚型，其中PDGF-BB 主要位于肝脏，促HSC增殖的作用也最强，能促进HSC活化增殖、胶原分泌，是目前已知的促HSC增殖的细胞因子和促有丝分裂原；病理条件下静止的HSC表型会被激活，在肝纤维化进程中扮演着重要角色，能促使肝内的细胞-细胞、细胞-基质、基质-介质间相互作用，在复杂的网络系统中，促使细胞大量增殖；合成并分泌以胶原为主的ECM 和细胞因子、表达α-SMA、多种细胞因子及其受体、同时具有收缩功能。因此抑制rrPDGF-BB 对HSC的生物学作用对防治肝纤维化有重要的意义。

ERK1/2可被多种癌基因产物激活后向核内传递信号，磷酸化和活化核内的效应分子，调节下游核转录因子的表达，如c-myc、c-fos、c-jun、cyclin-D1、Bcl-2等，最终启动与调节细胞的生长、发育、分化、凋亡等多种生理过程相关的靶基因转录，发挥促进细胞的增殖、浸润、转移与恶性转化的功能[10]。c-fos和c-jun在成人正常组织中低表达，而在许多恶性肿瘤及其癌前病变中出现过度表达[11-12]。提示c-fos和c-jun的激活是细胞由正常状态向疾病状态转化的一个重要的生物学标志[13]。RT-PCR扩增检测ERK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun、Collagen Ⅰ mRNA研究结果提示，PDGF/ERK1/2信号通路被激活，CPhGs可能通过阻断PDGF/ERK信号通路中ERK1/2、c-fos、c-jun、α-SMA、Collagen Ⅰ mRNA表达而起到治疗肝纤维化的作用。所以rrPDGF-BB作为一种损伤因素参与到肝纤维化的过程中，防治肝纤维化的重要途径之一是阻断rrPDGF-BB对HSC的生物学作用。

Fig 3　Effects of CPhGs on protein expression of ERK1/2,p-ERK1/2 and Collagen Ⅰ in HSC

A:ERK1/2protein level；B:p-ERK1/2protein level；C:Collagen Ⅰ protein level.*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsrrPDGF-BB group.1:Normal;2:rrPDGF-BB;3:PC 100 mg·L-1;4:PC 75 mg·L-1;5:PC 50 mg·L-1;6:PC 25 mg·L-1

有研究[14-15]发现HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达与ERK1/2有关，抑制HSC ERK1/2的活化或表达后，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达将被抑制，ERK1/2的表达随着肝纤维化的进展而明显增加，且与α-SMA的分布正相关[16]。因此以CPhGs作为干预药物，观察CPhGs对rrPDGF-BB 刺激的HSC增殖活性、Ⅰ型胶原、ERK1/2与α-SMA 表达的影响，可能成为CPhGs治疗肝纤维化的作用靶点。本研究结果显示，50～100 mg·L-1浓度的CPhGs，对rrPDGF-BB 刺激的HSC增殖活性具有明显的抑制作用，除25 mg·L-1浓度的CPhGs对rrPDGF-BB 刺激的HSC ERK1/2mRNA的表达无明显差异外，其余浓度组的CPhGs ERK1/2及α-SMA mRNA的表达均有明显抑制作用，对rrPDGF-BB 刺激的HSC ERK1/2、p-ERK1/2和Collagen Ⅰ蛋白表达也具有抑制作用，随CPhGs浓度的增加抑制作用增强。

肉苁蓉作为一种名贵的中药材，在推动新疆特色沙漠产业的发展中具有重要地位；本研究对CPhGs药物的抗肝纤维化作用及机制进行研究，显示CPhGs能够阻断PDGF介导的HSC的活化及增殖作用，同时抑制胶原纤维蛋白的分泌，这可能是通过CPhGs药物干扰PDGF/ERK信号级联系统的相关信号分子及其磷酸化水平、抑制PDGF诱导的HSC活化和增殖来实现的。

(致谢:本实验主要在新疆医科大学第一临床医学院科技楼6楼细胞室及分子实验室完成，在此特别感谢实验室的负责老师及研究生同学的支持与帮助！)

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Effects of phenylethanol glycosides from Cistanche tubulosa on proliferation of rat HSC induced by PDGF-BB and its mechanism

YOU Shu-ping1，ZHAO Jun2，MA Long1，ZHANG Shi-lei1，LIU Tao1

(1.CollegeofPublicHealth，XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2.XinjiangUygurAutonomousRegionInstituteofMateriaMedica,Urumqi830004,China)

AimTo investigate the effect of phenylethanol glycosides from Cistanche tubulosa(CPhGs) on the proliferation and activation of rrPDGF-BB induced HSC and their target points for resisting hepatic fibrosis,to elucidate the molecular mechanism in molecular level, and provide basic data for the further development of new drugs.MethodsHSCs were cultivated by CPhGs with different concentrations(0, 3.91, 7.81, 15.63, 31.25, 62.50, 125.00, 250.00, and 500 mg·L-1) and IC50of CPhGs was determined. CPhGs with different concentrations(25，50，75，100 mg·L-1) were selected, and after the cells were stimulated with rrPDGF-BB, cell proliferation was determined by MTT. ERK1/2,α-SMA, c-fos, c-jun and Collagen I mRNA and Erk1/2,P-Erk1/2and Collagen Ⅰ protein expressions were assayed by RT-PCR and Western blot. ResultsCPhGs of (50～100)mg·L-1concentrations groups could effectively inhibit rrPDGF-BB-mediated proliferation(P<0.05) and CPhGs of(25～100)mg·L-1concentrations groups had no significant cytotoxicity(P>0.05). CPhGs of(25～100)mg·L-1concentrations groups could inhibit ERK1/2,α-SMA,c-fos, c-jun and Collagen Ⅰ mRNA levels, and also obviously inhibited Erk1/2,P-Erk1/2and Collagen Ⅰ protein expression on HSC.ConclusionsCPhGs has the protective effect against hepatic fibrosis. The mechanism of this process may involve the interference with PDGF/ERK1/2 signaling pathway and inhibiting the activation and proliferation of HSC.

phenylethanol glycosides from Cistanche tubulosa; platelet derived growth factor; hepatic stellate cells; hepatic fibrosis; cell proliferation;signaling pathway;mechanism

2016-05-31,

2016-06-27

国家自然科学基金项目(No 81260624)

由淑萍(1979-)，女，博士生，副教授，研究方向：食品毒理学，E-mail：youshupin@163.com；

刘涛(1974-)，女，博士，教授，研究方向：新疆特色药食兼用植物的作用及其机制研究，通讯作者，E-mail：xjmult@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.009

A

1001-1978(2016)09-1231-05

R-332；R284.1；R322.47；R329.24；R575.202.2；R977.6

网络出版时间：2016-8-23 14:29:00网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.018.html