云南省62例发热患者中蚊传虫媒病毒感染的病原学检测

黄瑛　付士红　史蕾　陈海云　曹玉玺　何花　李晓龙　罗云　崔世恒　徐俊　王力华　李文明　顾大勇　徐云龙　梁国栋

650041 昆明，云南省昆明市第三人民医院(黄瑛、陈海云、何花、罗云、徐俊、李文明)；102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(付士红、曹玉玺、李晓龙、崔世恒、王力华、梁国栋)；518033 深圳国际旅行卫生保健中心(史蕾、顾大勇、徐云庆)



·论著·

云南省62例发热患者中蚊传虫媒病毒感染的病原学检测

黄瑛付士红史蕾陈海云曹玉玺何花李晓龙罗云崔世恒徐俊王力华李文明顾大勇徐云龙梁国栋

650041 昆明，云南省昆明市第三人民医院(黄瑛、陈海云、何花、罗云、徐俊、李文明)；102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(付士红、曹玉玺、李晓龙、崔世恒、王力华、梁国栋)；518033 深圳国际旅行卫生保健中心(史蕾、顾大勇、徐云庆)

黄瑛，付士红和史蕾同为第一作者

目的查明云南省疑似蚊传虫媒病毒感染的发热患者中病原体的种类及生物学特性。方法针对2013年昆明市第三人民医院传染科收集的62例疑似蚊传虫媒病毒感染发热患者急性期血清标本，使用血清学和分子生物学方法对这些标本开展3种蚊媒病毒(登革病毒、乙脑病毒和基孔肯雅病毒)感染的检测。结果62例血清标本中，27例呈现蚊媒病毒感染阳性，占全部病例44%(27/62)。检测阳性患者中，82%(22/27)为登革病毒感染，18%(5/27)为乙脑病毒感染，未检测到基孔肯雅病毒感染阳性。全部登革病毒感染患者均显示登革病毒IgM抗体阳性，其中含12例患者呈登革病毒基因检测阳性。登革病毒分型结果显示，12例登革病毒基因检测阳性标本中含有3种血清型登革病毒，分别为，1型登革病毒(5例)，3型登革病毒(5例)，4型登革病毒感染(2例)。5例病例标本为乙脑病毒IgM抗体阳性，未检测到乙脑病毒基因阳性。流行病学分析结果显示，登革和乙脑病例主要发生在6-10月。且22例登革病毒感染中19例患者为输入性病例。结论云南省疑似蚊传病毒感染发热患者以登革病毒感染为主，且登革病毒感染阳性病例大部分为输入性病例，感染的登革病毒来源于东南亚国家的流行株。

【主题词】发热患者；蚊媒病毒；登革热

由于蚊虫传播病毒可随货物运输或者人群流动等传播到异地造成疾病在新的地区的流行，成为当地“新发传染病”[1,2]，因此，蚊传虫媒病毒的检测与监测，特别是在边境地区的蚊传虫媒病毒感染患者的检测与监测引起各个国家的关注[3]。近年来中国发生多起由输入病例引起登革热[4]和基孔肯雅热在当地的局部流行，造成了巨大疾病负担，同时对当地公共卫生带来巨大威胁。

为了查明发热患者中病原体感染的种类，本研究对2013年本院全年收集的疑似蚊传虫媒病毒感染患者急性期血清做病原学检测，在患者急性期血清标本中检测到27例患者感染登革病毒或乙型脑炎病毒抗体或病毒核酸，其中大部分为老挝，缅甸国的输入性病例。

1　材料与方法

1.1标本采集2013年1-12月在昆明市第三人民医院传染科收集发热病例患者，临床医生根据病例临床症状和流行病学信息等筛选出疑似蚊虫传播病毒感染患者并分别采集患者急性期血清标本。采集急性期血液，实验室分离血清，分装后保存于超低温冰箱备检。

1.2标本检测由于所有标本均采集自临床发热患者急性期标本，因此本研究仅选择病原体感染早期的核酸检测和病毒特异性IgM抗体检测。每一份血清标本分别平行检测3种蚊媒传播病毒(登革病毒、乙脑病毒、基孔肯雅病毒)的核酸与病毒IgM抗体。

1.2.1Real-time RT-PCR检测虫媒病毒基因:按照QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) 试剂盒说明书使用提取血清中RNA。使用三种病毒(登革病毒，乙脑病毒，基孔肯雅病毒)基因扩增引物检测。使用Applied BioSystems 7500 Real Time PCR Machine (Life Technologies Corporation, CA, USA).开展Real-time RT-PCR扩增。使用一步发扩增病毒基因(the AgPath-IDTM One-Step RT-PCR Kit (Life Technologies Corporation, CA, USA)。每一反应体系为25 μl，其中12.5 μl缓冲液，3.5 μl无核酸酶液体, 1 μl 25×RT-PCR Enzyme Mix, 1 μl引物(10 μmol/L)，1 μl探针(3 μmol/L)和5 μl RNA提取液。反转录50℃30 min，包括95℃5 min，40个循环，95℃10 s，55℃45 s。判定标准：Ct值小于等于35为阳性。

1.2.2蚊媒病原体特异性IgM抗体及抗原检测:乙脑病毒、登革病毒和基孔肯雅病毒IgM抗体试剂盒为澳大利亚产品：乙脑/登革检测试剂为JE-DENGUE IgM COMBO ELISA (Ref：E-JEDOIC; Lot:13156, Panbio, Australia)；基孔肯雅病毒检测试剂Chikungunya Virus IgM Capture ELISA (Ref:CHIM0590; Lot:CHIM-039; NOVATEC, Germany)。各种检测严格按照试剂盒说明书要求操作。

1.2.3病毒分离：将患者急性期血清平行接种蚊虫细胞系(C6/36)单层和哺乳动物细胞(BHK)单层，分别于28℃和37℃培养，逐日观察细胞病变(CPE)。

2　结果

2.1标本采集昆明市第三人民医院传染科共收集到62例疑似蚊传虫媒病毒感染患者急性期血清标本和相关流行病学信息。图1可见各月采集标本数量，62例病例除1月和11月份以外，在其他各月均有分布，其中6-10月病例占全年总病例数的79%(49/62)。

2.2蚊传虫媒病毒检测通过对每一份标本的病毒基因扩增和病毒特异性IgM抗体的平行检测，发现22例病例为登革病毒IgM抗体阳性，12例登革病毒基因检测阳性，5例乙脑IgM抗体阳性(表1)。

2.2.1蚊传虫媒病毒基因检测：

2.2.1.1登革病毒基因检测：对所有62例患者标本首先进行登革病毒基因通用引物的检测，并对阳性标本开展1-4血清型登革病毒基因检测。结果显示，62例患者标本中12例为登革病毒通用引物基因检测阳性。登革病毒分型检测结果显示：5例为登革1型病毒、5例为登革3型病毒、2例为登革4型病毒，未检测到登革2型病毒阳性。

表1　昆明市第三人民医院诊治蚊传虫媒病毒感染患者信息

图1　蚊传虫媒病毒感染病例时间分布Fig.1　Time distribution of mosquito borne virus infection cases)

2.2.1.2乙脑病毒和基孔肯雅病毒基因检测： 对62例患者标本平行检测乙脑病毒和基孔肯雅病毒基因，检测结果均为阴性。

2.2.2蚊传虫媒病毒IgM抗体检测：2.2.2.1登革病毒和乙脑病毒IgM抗体检测： 使用乙脑和登革病毒IgM抗体联合检测试剂盒对所有血清标本进行检测，结果显示，62例患者标本中22例标本为登革病毒IgM抗体阳性，5例为乙脑病毒IgM抗体阳性。使用乙脑病毒IgM抗体单项检测试剂对标本进行再次检测，检测结果与乙脑和登革病毒IgM抗体联合检测试剂的检测结果相同。2.2.2.2基孔肯雅病毒IgM抗体检测：62例患者血清标本的基孔肯雅病毒IgM抗体检测均为阴性。2.3病毒分离所有62份临床发热患者急性期血清标本分别接种于蚊虫组织培养细胞(C6/36)和哺乳动物组织培养细胞(BHK)。接种后逐日观察细胞病变，连续培养至第5天与对照组相比未见明显异常。将细胞培养上清液平行检测登革病毒，乙脑病毒和基孔肯雅病毒核酸，结果均为阴性。2.4蚊传虫媒病毒感染的时间分布登革病毒感染病例集中在6-10月，而乙脑病例则分布在7，9和10月。22例登革病例中19例患者在患病前曾有过缅甸，老挝和泰国等东南亚国家的旅行史，或为来自于这些国家的公民(表1)。

3　讨论

登革热被认为是人类面临的最重要的蚊媒传染病[5,6]。本研究所检测到的22例登革病毒感染阳性患者中，只有3例患者为西双版纳居民；其余19例患者中有17例具有到缅甸、老挝和泰国工作，经商或者旅游的经历，另外2例分别为缅甸和泰国公民。这些患者中一部分为在国外居住期间患病而到昆明市第三人民医院就诊，一部分为从当年登革热流行地区的西双版纳和瑞丽医院转诊到本医院就诊。可见本次登革病毒检测阳性患者中大部分为国外感染的输入性病例和云南省登革流行区的登革热病例，无昆明市本地病例。

根据登革病毒全基因组分子遗传进化分析发现，在我国南方流行的登革病毒毒株为输入性[6]。本研究中含12例登革病毒基因检测阳性标本，分子分型研究显示12例阳性标本中包含三种血清型登革病毒，分别来自泰国3例(2例1型，1例3型)，缅甸5例(3例1型，2例4型)，老挝2例(均为3型)，西双版纳2例(3型)。鉴于本研究中22例登革病毒感染阳性患者中19例具有东南亚国家旅行史，而这些患者感染的登革病毒与所在国流行的登革病毒相一致，可见以上病例感染的病毒主要来源于东南亚国家流行的病毒。

云南省西双版纳和瑞丽市出现登革热暴发流行的疫情，登革病毒分子生物学研究结果显示，西双版纳分离43株登革病毒均为登革3型病毒[7]。而瑞丽登革热流行期间5株为登革病毒1型，而其他12株均为2型登革病毒[8]，病毒分子遗传学分析发现这些毒株均与新加坡、泰国、柬埔寨等东南亚国际流行株亲缘关系最近，提示当地流行毒株为东南亚输入性病毒。

数据分析发现就登革热患者而言，临床诊断与实验室检测结果具有较高一致性。此外，本检测结果发现5例患者标本为乙脑病毒IgM抗体阳性，根据世界卫生组织(WHO)指南可以诊断为乙脑病毒感染[9]，但是临床诊断中无一例为乙脑患者。众所周知，乙脑多发生于15岁以下儿童[10，11]，而此次检测5例乙脑病毒感染患者年龄在27-49岁之间，为成人乙脑病例，无一例为儿童病例。5例乙脑患者标本未检测到病毒基因阳性，无法从病毒基因组角度分析其感染来源，也无法了解其原始感染是在境外或是在我国境内感染，今后应该加强云南省大年龄组乙脑病毒感染病例的流行病学和病毒基因组研究。

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Detection of mosquito-borne arbovirus infectious in sixty two feverish patients of Yunnan

HuangYing,FuShihong,ShiLei,ChenHaiyun,CaoYuxi,HeHua,LiXiaolong,LuoYun,CuiShiheng,XuJun,WangLihua,LiWenming,GuDayong,XuYunlong,LiangGuodong

3rdpeople′shospitalinkunmingofYunnanprovince,Kunming650041,China(HuangY,ChenHY,HeH,LuoY,XuJ,LiWM);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(FuSH,CaoYX,LiXL,CuiSH,WangLH,LiangGD);ShenZhenInternationalTravelHealthcareCenter,,Shenzhen518000,China(ShiL,GuDY,XuYL)

HuangYing,FuShihongandShiLeiarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticle

HuanYing,Email:hyxanni6@sina.com;LiangGuodong,Email:gdliang@hotmail.com

ObjectiveTo find out the pathogens that caused the feverish patients suspected with mosquito-borne arboviral infection in Yunnan. MethodsTotally 62 acute phase serum samples were collected from the feverish patients suspected with mosquito-borne arboviral infection in the third people′s hospital of Kunming city. The detection of three kinds of mosquito-borne virus, including Dengue virus (DENV), Japanese encephalitis virus (JEV) and Chikungunya virus (CHKV), were carried out using molecular biological methods and serological methods. ResultsThe results show that 27 serum samples are tested positive to mosquito-borne viral infection, accounting for 44% of all cases (27/62). Among these positive cases, 82% (22/27) of them are DENV infection, 18% (5/27) JEV infection, and no CHKV infection cases. All the DENV cases are shown DENV IgM antibody positive, which include 12 cases nucleotide test positive to DENV. DENV genotyping results indicate that three different genotypes are identified among these 12 nucleotide-positive cases, namely genotype 1 (5 cases), genotype 3 (5 cases) and genotype 4 (2 cases). In addition, there are also 5 JEV IgM antibody-positive cases and JEV nucleotide-positive cases are not identified. The epidemiological analysis reveals that cases of DENV and JEV are mainly distributed in June to October. And 19 cases among the DENV infection cases (n=22) are imported cases. ConclusionsDENV infection cases have a large proportion of suspected cases with mosquito-borne arboviral infection in Yunnan, and these DENV-positive cases are mainly imported cases. The strains of DENV identified in this study are primarily derived from Southeast Asian countries.

Patients with fever; Mosquito-borne viruses; Dengue fever

黄瑛，Email:hgxami6@sina.com;梁国栋，gdliang@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.004

2016-04-07)