金线鱼鱼皮抗冻蛋白理化性质的研究

2016-09-28吴珊陈培琳周雨嘉傅维擎曾红亮郑宝东张怡

福建轻纺 2016年12期

关键词：亲水性鱼皮乳化

吴珊，陈培琳，周雨嘉，傅维擎，曾红亮，郑宝东，张怡

（1．福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002；2．宁德师范学院，福建宁德 352100）

金线鱼鱼皮抗冻蛋白理化性质
的研究

吴珊1,2，陈培琳1，周雨嘉1，傅维擎1，曾红亮1，郑宝东1，张怡1

（1．福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002；2．宁德师范学院，福建宁德 352100）

为了研究金线鱼鱼皮抗冻蛋白的理化性质，文章以金线鱼鱼皮抗冻蛋白为原料，对其等电点、亲水性、表面疏水性、热稳定性、起泡性以及乳化性等理化性质进行研究。结果表明，金线鱼鱼皮抗冻蛋白的等电点为pH4；其水分完全挥发温度为174℃，显著高于PBS（磷酸缓冲液）及BSA（牛血清蛋白），表明该抗冻蛋白增大了体系中水分蒸发的难度；加热至81.40℃时，鱼皮抗冻蛋白失去热滞活性，表明鱼皮抗冻蛋白属于非热稳定抗冻蛋白。

金线鱼；鱼皮；抗冻蛋白；理化性质

金线鱼是鲈形目(Perciformes)金线鱼科(Nemipteridae)金线鱼属(Nemipterus)的其中一个物种[1]，主要分布于西太平洋区，包括日本、韩国、中国、菲律宾、印尼、越南、泰国、澳洲等海域，中国产于南海、东海和黄海南部，以南海产量较多[2]，是主要的海产鱼类。金线鱼肉质细嫩，常常将其加工为鱼糜制品[3]。在鱼糜制品加工过程中，通常利用金线鱼鱼肉作为食品原料，因此造成大量金线鱼的鱼头、鱼皮、鱼鳞、鱼骨等原材料的浪费，为了提高金线鱼的利用价值，将鱼皮进一步开发成为鱼皮抗冻蛋白具有广阔的前景。抗冻蛋白（AFPs）是一类具有提高生物抗冻能力的蛋白质类化合物的总称[4]。抗冻蛋白能与冰晶相互作用，抑制冰的重结晶化和修饰冰晶[5]。蛋白质酶解产物与蛋白质的理化性质存在较大差异，如等电点、亲水性、表面疏水性、热稳定性、起泡性、乳化性以及氨基酸组成等[6]，这些性质的差异导致其加工特性及生理功能的不一致。

因此，文章以金线鱼鱼皮抗冻蛋白为原料，对其等电点、亲水性、表面疏水性、热稳定性、起泡性以及乳化性等理化性质进行研究，以便了解和掌握金线鱼鱼皮抗冻蛋白的加工适用性，以及为抗冻蛋白的产业化应用打下良好的基础。

1材料与仪器

1.1 试验材料

金线鱼鱼皮抗冻蛋白：实验室自制，冷冻干燥备用。

1.2 试验仪器

TGA/SDTA851e 热分析系统：瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；

DSC 200 F3差示扫描量热仪：德国耐驰仪器制造有限公司；

MK2000型INSTEC冷热台：北京美嘉图科技有限公司；

Ci-L型尼康显微镜：福州达士通仪器设备有限公司；

H1850R冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

LG-1.0型真空冷冻干燥机：新阳速冻设备制造有限公司；

UV-7200紫外可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；

Kjeltec TM 2300 半自动凯氏定氮仪，丹麦瑞典FOSS 公司。

2 试验方法

2.1 等电点测定

称取鱼皮抗冻蛋白样品与蒸馏水1:100（W/V）混合，用0.5mol/L NaOH调至pH8.0，室温搅拌1h后，6000r/min离心20min，取等量上清液，用0.5mol/L HCl调至不同pH值（pH3.0～7.0）沉淀蛋白质并离心，双缩脲法分别测定沉淀前后上清液中蛋白质含量，上清液中蛋白质残留率最低时的pH值即为蛋白质的等电点[7]。

2.2 亲水性测定

用热重/差热分析仪法分析鱼皮抗冻蛋白的亲水性[8]。具体步骤为：将样品溶于PBS中，配制20 mg/mL的抗冻蛋白溶液。移取20μL溶液于陶瓷坩埚中，待样品池稳定后，开始升温，升温区间为30℃～800℃，升温速率为5℃/min，保护氮气流速为10mL/min，记录升温过程中样品重量的变化并分别绘制TGA-SDTA曲线。分别以PBS、BSA为对照。

2.3 表面疏水性测定

将鱼皮抗冻蛋白溶解于PBS（10 mmol/L，pH 8.0）中使终浓度为1mg/mL，取2mL加入40μL 8-苯胺萘磺-1-酸盐（ANS）溶液进行荧光扫描，激发波长为375nm，发射波长为410nm～560nm。

2.4 热稳定性测定

采用DSC法鱼皮抗冻蛋白溶液的热稳定性进行分析。具体方法为：将浓度为20mg/mL的抗冻蛋白溶液密封在铝盘中，以空盘做参比，20℃恒温5min，然后以1℃/mL升温速率由30℃程序升温至90℃，恒温5min，记录升温过程中的热流变化，对热流曲线进行积分，获得的峰值温度即为抗冻蛋白的热变性温度。

2.5 起泡性和泡沫稳定性测定

将0.2g抗冻蛋白溶解到10mL缓冲液中，调节pH值，然后在高速组织捣碎机中均质（1 00 00 r/min～12000 r/min）2 min，制成乳浊液[9]。均质停止1min后，记录泡沫体积V1（mL），计算起泡性。均质停止20 min后，记录泡沫体积V2（mL），计算泡沫稳定性如下：

2.6 乳化性和乳化稳定性测定

取60mL0.1%调至不同pH值的待测样品，加入30ml芝麻油，在10000r/min，25℃下乳化不同的时间。然后以0.1%SDS溶液（十二烷基硫酸钠，pH7.0）稀释 100倍，测定500nm处的吸光度，以SDS溶液作为空白[10]。以乳化活性指数（Emulsifying Activity Index，EAI）表示，计算公式为：

式中：A500—500nm处吸光值；

C—溶液中样品蛋白质质量mg；

Φ—油相体积系数，取值0.25；

N—稀释倍数。

乳化稳定性（Emulsifying Stability Index，ESI）用乳化稳定性指数（ESl）表示，计算公式为：

式中：A0为零时刻的吸光值；△T为时间差（min）；△A为△T内的吸光值差。本试验中，每隔10分钟测定一次，故△T为定值。令K= A0/△A，则K与ESI成正比。为了避免计算时出现△A为0及负值，故引进吸光值比（K）来描述乳化稳定性。

3 实验结果

3.1 金线鱼鱼皮抗冻蛋白等电点分析

由图1可以看出，金线鱼鱼皮抗冻蛋白在pH4时易凝集成大颗粒，沉淀析出，故上清液中蛋白残留率最低，其上清液中蛋白残留率为53.0%，而在pH4两侧蛋白残留率均较高。因此，鱼皮抗冻蛋白的等电点范围为pH4.0左右。

3.2 金线鱼鱼皮抗冻蛋白亲水性分析

图2为样品加热过程中的TGA-SDTA曲线。样品溶解用的溶剂PBS、BSA用作对照。样品加热过程中溶质对水分的束缚能力能够一定程度上反映溶质的亲水能力。TGA能够反映物质在加热过程中重量的变化，其中样品重量损失90%时的温度可以定义为水分挥发完全的温度。PBS、BSA和AFP水分完全挥发的温度分别为137℃、164℃和174℃，即鱼皮抗冻蛋白的水分完全挥发温度显著高于PBS及BSA，表明该抗冻蛋白的加入增大了体系中水分蒸发的难度，即鱼皮抗冻蛋白具有较强的亲水性。SDTA曲线反应加热过程中由于样品吸热引起的样品与样品池温度的差异。200℃前，SDTA曲线变化剧烈，因为需要大量吸热用于水分挥发，样品与样品池之间具有较大的温度差；200℃左右，SDTA曲线趋于平缓，由于体系中水分完全挥发，不需要从外界吸收热量，样品与样品池温度达到一致；200℃后，SDTA曲线再次出现缓慢下降的趋势，因为样品中溶质加热分解需要从外界吸收热量，样品中溶质含量较低，吸热引起的样品与样品池间温度差异不显著。

3.3 金线鱼鱼皮抗冻蛋白表面疏水性分析

鱼皮抗冻蛋白表面疏水性荧光光谱图见图3。从图中可以看出鱼皮抗冻蛋白表面疏水性弱于BSA，可以认为鱼皮抗冻蛋白具有较强的亲水性，与TGASDTA曲线中关于鱼皮抗冻蛋白亲水性测定结果一致。

3.4 金线鱼鱼皮抗冻蛋白热稳定性分析

根据热处理过程中的稳定性，AFP可以分为热稳定AFP和非热稳定AFP。目前已获得的AFP中大部分为非热稳定AFP。AFP的热稳定现象是90年代开始研究的比较多的一种现象。这是因为，一方面由于热处理在食品加工中的广泛使用，明确AFP的热稳定性对其在食品工业中的应用很有必要；另一方面，在热稳定AFP纯化过程中可以通过加热处理使杂蛋白发生选择性变性沉淀并通过离心去除，从而大大简化纯化步骤，降低纯化成本。从图4中可以看出，鱼皮抗冻蛋白溶液的升温过程中形成放热曲线，同时对加热处理后的鱼皮抗冻蛋白的活性进行测定，结果表明热处理后，鱼皮抗冻蛋白失去热带活性，表明鱼皮抗冻蛋白属于非热稳定AFP，其热变性温度约81.40℃，因此，鱼皮抗冻蛋白不能耐受高温处理[11]。

3.5 金线鱼鱼皮抗冻蛋白起泡性和泡沫稳定性分析

由图5可知，pH值对起泡性的影响在酸性和碱性区域都有增加，而碱性区域起泡性的提高远超过酸性区域。说明起泡性与蛋白质的溶解性存在着一定的关系，溶解的蛋白有利于泡沫的形成。蛋白的表面疏水性由于净电荷的增加而减少，这样蛋白质的溶解性增加，有利于其在气-水界面迅速展开，卷入更多的空气形成泡沫。在抗冻蛋白等电点附近，其起泡性最低，泡沫稳定性最大。由图6可知，金线鱼鱼皮抗冻蛋白的起泡性和泡沫稳定性随浓度的增加呈上升的趋势[12]。多肽浓度较大时，蛋白质间的相互作用有利于形成较厚的吸附膜，使泡沫稳定性增加。

3.6 金线鱼鱼皮抗冻蛋白乳化性和乳化稳定性分析

pH值对鱼皮抗冻蛋白乳化性和乳化稳定性的影响如图7所示，在pH值为2～4范围内，鱼皮抗冻蛋白乳化性和乳化稳定性随着pH值的增加而降低；当pH值大于4之后，鱼皮抗冻蛋白乳化性和乳化稳定性随着pH值的增加而升高。pH值对鱼皮抗冻蛋白乳化性的影响和pH值对乳化稳定性的影响规律具有一致性，在抗冻蛋白等电点附近，其乳化性和乳化稳定性最低。浓度对鱼皮抗冻蛋白乳化性和乳化稳定性的影响如图8所示，在2～12mg/mL浓度范围内，随着抗冻蛋白浓度的增加，其乳化性降低，乳化稳定性升高。低蛋白浓度时，肽的快速吸收，形成较好的扩散作用，有效促进多肽与油的相互作用；高蛋白浓度时，活化能屏障不允许蛋白以扩散的方式移动，导致多肽的聚集，进而降低乳化性能。

4 结论

金线鱼鱼皮抗冻蛋白的等电点为pH4；其水分完全挥发温度为174℃，显著高于PBS及BSA，表明该抗冻蛋白增大了体系中水分蒸发的难度，即鱼皮抗冻蛋白具有较强的亲水性；鱼皮抗冻蛋白的表面疏水性弱于BSA，可认为其具较强的亲水性；加热至81.40℃时，鱼皮抗冻蛋白开始失去热滞活性，表明鱼皮抗冻蛋白属于非热稳定抗冻蛋白；在等电点附近，其乳化性、乳化稳定性和起泡性最小，而起泡稳定性在这点最大；随着浓度的增大，抗冻蛋白的起泡性、起泡稳定性和乳化稳定性逐渐增大，乳化性降低。

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