复合酶法提取芹菜籽油的新技术研究

徐国良，李雄辉，袁菊如，胡居吾，涂招秀

（江西省科学院，江西南昌 330096）

复合酶法提取芹菜籽油的新技术研究

徐国良*，李雄辉，袁菊如，胡居吾，涂招秀

（江西省科学院，江西南昌 330096）

芹菜籽为原料，采用单因素法与正交设计法对复合酶法提取芹菜籽油的工艺条件进行优选，并对自提的芹菜籽油化学成分进行GC-M S分析，实验结果表明最佳工艺条件为：选择中性蛋白酶和中温α淀粉酶（1∶1比例）复合使用，酶添加量为1.7%，料液比1∶6，pH为6.2，55℃酶解4h。在此工艺条件下，芹菜籽油的提取率45.6%，芹菜籽油总得率为4.1%；用GC-M S从芹菜籽油中共鉴定出23种化合物。

芹菜籽；芹菜籽油；复合酶法；纤维素酶；α-淀粉酶；酶法提取

1 高脂血症的危害

对人体来说，高脂血症的危害很大。大量研究已证实，血脂过高是加速动脉粥样硬化多个因素中的最危险（易患）因素。高脂血症是脑卒中、冠心病、心肌梗死、心脏猝死等的危险因素。

芹菜籽所含降压、降脂成分是芹菜的50倍，芹菜、芹菜籽油对脑衰老和脑缺血具有防治作用。研究表明，芹菜籽中油脂含量丰富，含有多种药理活性成分，具有散气、消肿、利尿、抗肿瘤及抗衰老等功效。现已有研究从多个方面研究了芹菜籽油的药理作用[1-3]。

2 研究方法及工艺参数的选择

2.1 原料

芹菜籽（旱芹的种子，购于洪城大市场）。

2.2 仪器与试剂

果胶酶（1万U/g）、纤维素酶（1万U/g）、碱性蛋白酶（20万U/g）、中性蛋白酶（20万U/g）、中温α淀粉酶（1万U/g）及耐高温α淀粉酶（1万U/g）均购于南宁东恒华道生物科技有限责任公司；BSA223S分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；Anke TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂。

2.3 试验方法

2.3.1 芹菜籽预处理

将芹菜籽挑选、去除杂物，置于-60℃冰箱中放置2h后，立刻粉碎，备用。

2.3.2 芹菜籽成分的测定

1）水分的测定：取适量芹菜籽，快速粉碎，立即用水分测定仪测定芹菜籽中的水分含量。平行测定3次，取平均值。

2）粗脂肪的测定：参考GB/T 5512-2008，食品中粗脂肪的测定（索氏抽提法）。

3）分光度法。

2.3.3 芹菜籽油理化性质的测定

1）折光指数的测定：参照GB/T 5527-2010动植物油脂折光指数的测定[4]。

2）过氧化值（POV值）的测定：参照GB/T5538-2005动植物油脂过氧化值测定[5]。

3）酸值的测定：参照GB/T 5530-2005动植物油脂酸值和酸度测定[6]。

4）皂化值的测定：参照GB/T 5534-2008动植物油脂皂化值的测定[7]。

5）碘值的测定：参照GB/T 5532-2008动植物油脂碘值的测定[8]。

2.3.4 芹菜籽油提取工艺流程

芹菜籽→干燥粉碎→加水并调节pH→微波30s→超声400W 10min→加酶，适宜温度酶解→升温灭酶→ 冷却→离心分离→ 芹菜籽油。

其中，芹菜籽提取率的计算公式如下：Y(%)＝W1/W2×100%。式中，Y—提取率；W1—提取芹菜籽油质量，g；W2—粉碎的芹菜籽含油质量，g。

2.3.5 芹菜籽油脂肪酸组成GC-MS分析

2.3.5.1 甲酯化

采用H2SO4-CH3OH水浴法，称取约0.2g芹菜籽油于25mL具塞试管中，加入5% H2SO4-CH3OH溶液2mL，震荡使充分均匀，于60℃水浴甲酯化反应20min，冷却后加入C6H142mL，收集C6H14层（淡黄色），加入少量无水Na2SO4（目的是脱水），密封备用。

2.3.5.2 GC-MS分析

气相色谱条件：色谱柱为DB-35MS弹性石英毛细管色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）初始温度为65℃保持2min，毛细管柱采用程序升温，升温速率5℃/min至250℃，保持20min，进样口温度为250℃，载气为氦气，载气流速为1.2mL/min，分流比为20∶1，气化室及检测器的温度均为300℃。

3 结果与分析

3.1 芹菜籽组成成分分析

采用粉碎过80目筛后的芹菜籽为原料进行成分测定，结果如表1所示。

表1 芹菜籽组成

3.2 单因素实验结果

3.2.1 不同酶对提取率的影响

以过80目筛的芹菜籽为原料，分别选用果胶酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、中温α淀粉酶及耐高温α淀粉酶，酶用量为2%，料液比为1∶5 （g/mL），酶解时间为4h，pH和温度均为所用酶的最佳值，酶解完成后于90℃灭酶10min，冷却后于4 000r/min离心20min，取上层清液再离心20min后得上层液，计算出芹菜籽油的提取率，结果见图1。

图1 酶的种类与提取率的关系

由图1可知，单独使用酶的提取率均不佳，效果最好的为中性蛋白酶，其提取率为16.06%（未达60.00%），其次为中温α淀粉酶，其提取率为10.45%，其余酶的提取率均不高。因此，选择中性蛋白酶和中温α淀粉酶（1∶1比例）复合使用，以提高酶解速度，减小酶用量。

3.2.2 酶用量对芹菜籽油提取率的影响

分别使用0.50%、1.00%、1.50%、2.00%和2.50%的中型蛋白酶和中温α淀粉酶（1∶1比例），不同酶用量下的芹菜籽油提取率结果如图2所示。

图2 酶用量对芹菜籽油提取率的影响

从图2可以看出，随着酶添加量的增加，芹菜籽油的提取率也随之升高。酶添加量在1.50%～2.00%时，芹菜籽油提取率变化较小。当酶添加量超过2.00%后，油脂的提取率增加幅度很小，说明继续增加酶添加量已无意义。从经济性角度考虑，确定1.50%的比例为最佳酶添加量。

3.2.3 料液比对芹菜籽油提取率的影响

固定酶解温度为55℃，酶解时间为4h，酶解pH 为6.0，只改变料液比，测定芹菜籽油提取率的结果如图3所示。

图3 料液比对芹菜籽油提取率的影响

由图3可知，料液比对芹菜籽油的提取率油重要影响，料液比在1∶6以下时，油脂的提取率呈上升趋势。这可能是由于料液比较小时，底物中浆液粘度大，体系流动性差，提取率低；随着料液比的增大，底物浓度和酶浓度达到最优时，提取率最大，此时料液比为1∶6；随着料液比的增大，底物浓度和酶浓度开始慢慢稀释，提取率下降。

3.2.4 酶解pH对芹菜籽油提取率的影响

固定酶解温度为55℃，酶解时间为4h，料液比为1∶6的条件下，只改变酶解pH，测定芹菜籽油提取率的结果如图4。

图4 酶解pH对芹菜籽油提取率的影响

由图4表明，芹菜籽油提取率随着酶解pH的升高而迅速增加，在pH 6.2时达到最高，芹菜籽油提取率为32.80%。但当pH超过6.2时，提取率随pH的升高而下降，这可能与中性蛋白酶和中温α淀粉酶的最适酶解pH有关，当酶解pH偏离其最适pH时不利于中性蛋白酶和中温α淀粉酶作用，酶活下降严重，细胞壁的破坏效果减弱不利于芹菜籽油的萃取。

3.2.5 芹菜籽油提取工艺条件的优化

根据上述单因素的实验研究结果发现，料液比（A）、酶用量（B）和pH值（C）对芹菜籽油得率影响较大。因此，采用三因素三水平的正交试验方法对工艺条件进行优化，以芹菜籽油得率为评价指标，设计方案见表1。按表1对进行实验，各处理做3次平行，测定芹菜籽油得率，取平均值，并作极差和方差分析，结果见表2、3。

表1 正交实验因素水平表

表2 正交实验设计及结果

表3 正交试验结果方差分析表

F0.05（2，2）=19。

从表3比较3个因素的极差R值，RB＞RC＞RA，即酶用量＞pH值＞液料比，说明因素B对指标的影响最大。根据K值实验结果可见，最佳工艺组合为A2B3C2，即液固比6∶1，pH值6.2，酶用量1.70%。

3.2.6 芹菜籽油收集

实验以倾倒料液时料与液的分离难易程度，加水振荡料层后倾倒时物料洗出程度，乳化物层厚度及清油层厚度为评价标准，研究离心时转速及时间对提油率的影响。

表4 芹菜籽油的理化性质

表5 芹菜籽油化学成分分析结果

当转速在3 500～4 500rpm时，选择离心时间为45min，料与液的分离效果不明显，倾倒时料与液难以分离，且上层油层乳化现象严重，油层颜色呈蛋黄色，清油层薄之不可见。

图5 芹菜籽油总离子流图

当离心转速为7 000～8 500rpm时，选择离心时间为15min，离心即能达到料与液分离的目的，溶液可轻易的倾倒出离心杯，清油层与乳化物层界限明显，加水振荡物料层有少量或极少物料被洗脱，说明离心后物料厚实沉积在离心杯底部，达到分离的目的。

离心后将收集到的芹菜籽油过无水硫酸钠层，即得芹菜籽油，芹菜籽油总得率为4.10%，芹菜籽油提取率为45.60%。

3.3 芹菜籽油的理化性质

芹菜籽油呈棕绿色，澄清透明，室温下流动性良好，具有强烈持久辛香、药草香气。

相关理化性质以及与大豆原油、花生原油、芝麻原油的比较结果见表4。由表4可以看出，与其他3种植物原油相比，芹菜籽的折光指数与芝麻原油接近，高于大豆原油和花生原油；过氧化值与酸值均达到标准；皂化值均比大豆原油、花生原油和芝麻原油低，因此含有较多的不皂化物；碘值低于大豆原油和芝麻原油，与花生原油接近。综上分析比较，如果对芹菜籽油进行合理精制达到国家食用植物油脂相关标准后，预计可以成为一种植物油脂的新来源。

3.4 芹菜籽油化学成分GC-MS分析

取适量芹菜籽油，以无分流方式进样，进行GC-MS分析，得总离子流图，共分离出26个化学成分，结果见图5，经GC-MS计算机的NIST库自动检索，并查阅相关文献与标准图谱对照分析，鉴定了23种化学成分，用面积归一法计算出其相对含量，结果见表5。

从表5可以看出，用GC-MS从芹菜籽油中共鉴定出23种化合物，检出率达99.94%，其中酯类物质占86.55%；含量最高的为反式-9-十八烯酸甲酯（52.79%），其次分别为9,12-十八烷二烯酸甲酯（亚油酸）（17.26%），亚油酸是人体必需脂肪酸，对人体有多种生理功能，十六烷酸甲酯（9.68%），4-甲基苯酚（6.19%）等，都是该芹菜籽油的主要成分。

4 结论

根据实验结果，确定最佳工艺条件为：选择中性蛋白酶和中温α淀粉酶（1∶1比例）复合使用，酶添加量为1.70%，料液比1∶6，pH为6.2，55℃酶解4h，在此工艺条件下，芹菜籽油的提取率45.60%，芹菜籽油总得率为4.10%。由此试验可以看出，可能是由于芹菜籽油挥发油含量高。用GC-MS从芹菜籽油中共鉴定出23种化合物，检出率达98.30%，其中酯类物质占86.55%；含量最高的为反式-9-十八烯酸甲酯（52.79%），其次为9,12-十八烷二烯酸甲酯（亚油酸）（17.26%）。纤维素酶与α-淀粉酶复合使用工艺对芹菜籽油进行富集与分离工艺具有创新性突出的特点。

[1]王文宝,李杰,刘彦麟,等.芹菜籽粉对高脂膳食大鼠血脂及肝功能的影响[J].吉林医药学院学报,2012,6(33):143-145.

[2]徐成,沈志斌,丁倩,等.芹菜籽油抗脑缺血作用的研究[J].中成药,2007,29(6):44-45.

[3]刘辉.芹菜籽油的提取纯化及降血脂功能研究[D].沈阳:沈阳农业大学,2009:15-19.

[4]国家标准化管理委员会.GB/T 5527-2010 植物油脂检验折光指数测定法[S].北京:辽宁省粮油检验监测所等,2010.

[5]薛雅琳,张颖,刘建涛.GB/T 5538-2005 动植物油脂 过氧化值测定[S].北京:南京经济学院,2005.

[6]薛雅琳,张颖,呙琴.GB/T 5530-2005 动植物油脂 酸值和酸度测定[S].北京:国粮局西安油脂科研院,2005.

[7]张世宏,何东平,黄小平.GB/T 5534-2008 动植物油脂 皂化值的测定[S].北京:武汉工业学院、国家粮食储备局武汉科学研究设计院,2008.

[8]刘良忠,何东平,张世宏.GB/T 5532-2008 动植物油脂 碘值的测定[S].北京:武汉工业学院,2008.

Study on the Extraction of Celery Seed Oil by Complex Enzyme Method

Xu Guo-liang*, Li Xiong-hui, Yuan Ju-ru, Hu Ju-wu, Tu Zhao-xiu
(Jiangxi Academy of Sciences, Jiangxi Nanchang 330096)

Celery seeds as raw material, composite enzymatic extraction conditions of celery seed oil was optimized by single factor method and orthogonal design method and on the chemical composition of celery seed oil from the GCMS analysis the experimental results show that the selection of neutral protease and medium temperature amylase (1 ∶1) composite, enzyme dosage is 1.7%, the material liquid ratio 1 ∶ 6, pH 6.2, 55 ℃ enzymatic 4h, under this condition, celery seed oil extraction rate was 45.6%, total yield is 4.1% celery seed oil.From celery seed oil were identified 23 kinds of compounds with GC-MS.

Celery seed; Celery seed oil; Compound enzyme; Cellulase; Enzyme extraction

TS264.4

A

2096-0387（2016）01-0015-05

国家自然科学基金项目（项目编号31260400）。

徐国良（1964-），男，本科，副研究员，研究方向：天然产物。