WNT3A基因在先天性巨结肠症中的表达研究

西安交通大学医学院第二附属医院小儿外科(西安710004)

魏　强△　 陈　东△　徐　泉▲



WNT3A基因在先天性巨结肠症中的表达研究

西安交通大学医学院第二附属医院小儿外科(西安710004)

魏强△陈东△徐泉▲

目的：探讨WNT3A 基因及其相关蛋白在先天性巨结肠症(HD)中的表达及WNT3A与HD的发病关系。 方法：利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质印迹检测60例HD患者狭窄段(无神经节细胞)和正常段(有神经节细胞)肠管组织WNT3A的表达情况，并对其表达进行定量分析与比较。 结果：WNT3A在HD狭窄段肠管中mRNA表达量是正常段肠管中的2.6倍(P< 0.05 )。Western blot结果显示：WNT3A在HD狭窄段肠管中蛋白相对表达量为34.56 ± 3.21，在正常段肠管中蛋白相对含量为16.37 ± 2.46(P<0.05)。结论：WNT3A mRNA与蛋白在HD狭窄段肠管中高表达，提示WNT3A与HD 的发生有密切关系，可能在先天性消化道畸形的肠管发育中具有重要作用。

主题词Hirschsprung病/病理学WNT3A基因/代谢

先天性巨结肠症(Hirschsprung's disease, HD)是一种因肠神经系统发育异常所致的先天性消化道畸形，其发病率仅次于先天性肛门直肠畸形，位居第2位[1]。作为一种多基因遗传病，HD主要是由于胚胎期遗传因素和环境因素共同作用导致肠道神经嵴细胞异常发育所引起，遗传方面目前已经发现十余种基因与HSCR发病相关[2]。WNT3A是经典Wnt信号通路中的一个配体，可以激活Wnt信号通路，有研究发现：WNT3A在胚胎发育、细胞分化和肿瘤形成过程中起重要作用[3,4]。先天性巨结肠是在胚胎发育过程中肠神经系统发育异常所致的疾病，为此，我们利用荧光实时定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)、蛋白印迹(Western blot)检测WNT3A在HD狭窄段(无神经节细胞)和正常段(神经节细胞)中的表达水平，探讨WNT3A与HD的发病关系。

资料与方法

1材料与试剂

1.1标本来源：收集2009～2013年经钡灌肠、直肠肛管测压和术后病理切片证实的散发性HD狭窄段 (无神经节细胞段) 和正常段 (有神经节细胞段) 肠管组织标本60例，其中男41例，女19 例，年龄0.5～6.5 岁，平均1.8岁；所有对象均签订“知情同意书”。标本的留取均无菌取HD狭窄肠段和正常肠段肠管组织，一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定，另一部分放入经DEPC水处理后的无菌EP管中，立即放入液氮中速冻后置于 -80℃ 冰箱中保存。

1.2主要仪器及试剂：实时定量PCR仪(Roche Molecular Bioehemicals LightCycler Operator’s Manual Version 3.5 October 2000)、电泳仪(Bio-Rad Power/Pac3000)、 高速低温离 心机 (Heraus-Biofuge-PrimoR)、组织超声匀浆器(UP200H )、转印电泳槽(BIO-RA D)、显微镜(Nikon E800，分析软件NIS-EEMENtS br.3.0)；总RNA提取试剂盒 (Promage公司)，反转录试剂盒 SuperscriptTMⅡ Rnase H Reverse Transcriptase、SYBR Green I的PCR Master Mix (TaKaRa)、全蛋白提取试剂盒(南京凯基公司)、β- actin抗体(Sigma公司 )、WNT3A蛋白抗体(兔抗人，试剂编号：09-162，Millipore Co.)、DAB试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。

2方法

2.1qRT-PCR检测：①总RNA提取与定量：取各组织标本100mg，剪碎研磨，参照TRIzolTMRNA Isolation Reagent使用说明提取总RN A；RNA浓度检测 (紫外分光光度法)，-80 ℃保存；②cDNA合成： 应用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit将总RNA转录为cDNA，反转录(RT)体系10 μl，包括5×PrimescriptTMBuffer (for real time) 2 μl，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix Ⅰ 0.5 μl，Oligo dT Prime (50 μM ) 0.5 μl，Random 6mer (100 μM ) 0.5 μl，总RNA (< 500 ng)，Rnase Free dH2O 加至10 μl。 反应条件为 37℃ 15 min，85℃ 5 s；③qRT-PCR反应：采用SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒，取cDNA样品，分别作10倍倍比稀释(105、104、103、102、101、100copies/μl)，进行实时定量PCR检测，判断荧光定量PCR的扩增效率。在 12.5 μl反应体系中，倍比稀释浓度的cDNA样品和原液各加入 1 μl，加入SYBR荧光定量PCR混合试剂 6.25 μl及上、下游引物混合液 0.25 μl、灭菌超纯水补足至12.5 μl。荧光定量PCR仪进行反应(见表 1)；④qRT-PCR分析：分别测定每个样品WNT3A和β-actin mRNA的Ct值，每个样品均作三次重复管以减少操作误差。Ct值表示每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系，起始拷贝数越多，Ct值则越小。采用相对定量方式表示各样品WNT3A的△ Ct，△Ct = Ct目的基因 - Ct内参基因。再依据△△Ct = △Ct目的基因 - △Ct参照基因，计算2-△△ct。 当目的基因与内参基因的扩增效率接近时，2-△△ct表示所检测样品目的基因相对于参照基因的表达倍数。

表1　引物序列、产物大小及退火温度

2.2Western blot 检测： ①提取总蛋白：取各组织约50mg经剪碎、匀浆后低温离心，全蛋白提取试剂盒提取总蛋白(改良Lowry法测定蛋白)，-20℃保存备用；②电泳：取总蛋白 100 μl，加样品缓冲液(Loading buffer，按 4∶1 加入)，蛋白变性机 100℃ 变性 5min。经 5% SDS-PAGE积层胶、10% 分离胶 80v 电泳 120 min；③转印：按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸顺序转印，100V90 min；④封闭：转印完成后将 PVDF 膜放入 5% 脱脂奶粉液中封闭 1.0 h；⑤一抗杂交：PVDF膜在一抗溶液中 4℃ 过夜[兔抗人WNT3A (1∶1000稀释，分子量45kDa)和GADPH 抗体(1∶5000，TBST 配制，36kDa)]；⑥洗膜 10 min×3 次，将 PVDF 膜转加到辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG(浓度1∶2000)二抗溶液中室温抚育 1.5 h；⑦洗膜 10 min×3次，ECL 照相；⑧凝胶图像分析系统(GIS-2020凝胶图像扫描仪)扫描分析结果，以相对灰度值代表蛋白表达量，相对OD值 = WNT3A 的OD/β-actin OD。

3统计学方法所有数据均以均值 ± 标准差表示，采用 SPPS 13.0 统计软件进行两独立样本t检验，以P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有极显著性差异。

结　果

1 qRT-PCR结果WNT3A 在狭窄段肠管中 mRNA 的表达量是正常段肠管的 2.6 倍(见表 2)，由此可见，狭窄段WNT3A mRNA 表达显著高于正常段肠管的表达水平(P<0.05)，见图 1。

2Western blot 结果WNT3A 在 HD 狭窄段肠管中蛋白相对含量34.56 ± 3.21，在正常段肠管中蛋白相对含量为16.37 ± 2.46，二者相比有显著性差异(P<0.05)。由此可见，狭窄段WNT3A 蛋白的表达显著高于正常段肠管的表达水平，详见图 2。

图1HD WNT3A qRT-PCR 结果(A和C：溶解曲线；B和D：扩增曲线)

表2　WNT3A在mRNA水平上的相对表达量

图2WNT3A在HD中的蛋白表达结果 (WNT3A在 HD 中 Western Blot 检测结果：泳道1和3为HD 狭窄段；泳道2和4为 HD 正常段)

讨　论

HD是小儿最常见的先天性消化道畸形，发病率占存活婴儿的1/5000[1]，以病变肠管缺失神经节细胞致使肠道蠕动障碍为特点，临床常表现为生后胎粪排出延迟，腹胀等低位性肠梗阻，稍大小孩可表现为顽固性便秘。HD的发生和肠管神经系统的异常发育密切相关，并涉及一系列复杂的过程，包括神经节细胞在胚胎期不同阶段的异常发育[5,6]。WNT3A是WNT3A是经典Wnt信号通路中的一个配体，在经典Wnt信号通路中起重要作用。目前已有研究认为WNT3A 与神经形成和胚胎发育关系密切[3,7]。

在本研究中，我们选择了60例散发性HD患者的狭窄段和正常段肠管组织，通过qRT-PCR检测发现:

WNT3A 在狭窄段肠管中 mRNA 的表达量是正常段肠管的 2.6 倍。之后又通过Western blot对其在蛋白水平上进行了检测，得到了类似的结果，即WNT3A 蛋白在狭窄段的表达明显高于正常段的表达量。

WNT3A在胚胎发育过程中起重要作用，可促进神经细胞的形成和分化，先天性巨结肠患者由于某种原因使神经细胞迁移、分化异常，导致肠管神经节细胞缺如。在机体存在多种反馈调节机制，当肠管出现神经节细胞缺如时，可能通过开放某种通路使WNT3A表达上调，进而修复神经细胞的迁移异常。WNT3A是经典Wnt信号通路中的关键配体之一，主要通过经典Wnt 信号途径发挥生物学功能[7]。据此我们推测:胚胎发育过程中出现神经节细胞迁移异常时，可能通过经典Wnt信号通路促使WNT3A表达上调，试图使肠管神经节分布正常。

本研究证实：HD患者中WNT3A在 mRNA 和蛋白水平表达上调，说明WNT3A 可能参与HD的发生，是 HD 的病因之一，并在肠神经系统发育中起一定作用。但 HD 的发生并不是任何一个单一因素和指标所能完全解释的，因此进一步深入研究WNT3A 与 HD 发生发展的作用机制是十分必要的。

[1]Langer JC. Hirschsprung diseas [J]. Curr Opin Pediatr, 2013, 25(3): 368-374.

[2]Jiang Q, Ho YY, Hao L,etal. Copy number variants in candidate genes are genetic modifiers of Hirschsprung disease[J]. PLoS One, 2011, 6(6): e21219.

[3]Spence JR, Mayhew CN, Rankin SA,etal. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro[J]. Nature, 2011, 470(7332): 105-109.

[4]Qi L, Song W, Liu Z,etal. Wnt3a promotes the vasculogenic mimicry formation of colon cancer via Wnt/β-catenin signaling[J]. Int J Mol Sci, 2015,16(8): 18564-18579.

[5]Lake JI, Heuckeroth RO. Enteric nervous system development: migration, differentiation, and disease[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2013, 305(1): G1-24.

[6]Martucciello G. Hirschsprung's disease, one of the most difficult diagnoses in pediatric surgery: a review of the problems from clinical practice to the bench[J]. Eur J Pediatr Surg, 2008, 18(3):140-149.

[7]Lambert C, Cisternas P, Inestrosa NC. Role of wnt signaling in central nervous system injury[J]. Mol Neurobiol, 2016, 53(4):2297-2311.

(收稿：2016-03-20)

R725.7

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.09.005

△西安市儿童医院普外二科