样品处理方法对雷公藤叶中雷公藤甲素含量测定结果的影响

郑德杉,王三亚,汪文强,邓　奇,喻　昕

(湖北理工学院 医学院,湖北 黄石 435003)



样品处理方法对雷公藤叶中雷公藤甲素含量测定结果的影响

郑德杉,王三亚,汪文强,邓奇,喻昕*

(湖北理工学院 医学院,湖北 黄石 435003)

探讨用高效液相色谱法测定雷公藤叶中雷公藤甲素含量时，样品处理方法对含量测定结果的影响。分别用石油醚除杂—70%甲醇水提—氯仿萃取，乙酸乙酯提取—氧化铝柱分离，石油醚除杂—乙酸乙酯提取—氧化铝柱分离3种方法处理样品，采用HPLC法测定雷公藤甲素含量。结果为：石油醚除杂—70%甲醇水提—氯仿萃取处理得到的雷公藤甲素峰分离效果最好，色谱峰保留时间为19.732 min，与标准品的保留时间基本一致，含量高出后2种方法处理样品所得到的雷公藤样品溶液约4倍以上。在制订雷公藤叶中雷公藤甲素含量测定标准时，建议采用石油醚除杂—70%甲醇水提—氯仿萃取方法进行样品处理。

雷公藤叶；样品制备；HPLC法；色谱图

雷公藤在风湿性关节炎以及肿瘤治疗中发挥着重要的作用[1-2]，但由于人们长期忽视野生雷公藤种子资源的维护，导致野生雷公藤资源几近枯竭。国内唯一的雷公藤GAP种植基地福建泰宁的雷公藤根，由于种植周期需6年，生产成本高，单价已报至百元以上。雷公藤叶代替根应用于临床已成为趋势，雷络酯片的开发、雷公藤叶中提取雷公藤甲素单体的研究如火如荼。提取分离方法的选用严重影响到叶中雷公藤甲素含量测定结果的高低。张敏[3]采用与雷公藤根相似的甲醇提取、中性氧化铝柱分离的方法测定了6～7月采集的种源于泰宁扦插的雷公藤叶9份样品，其中4份样品中没有检测到雷公藤甲素，4份样品含量在0.5 μg/g以下，只有1份样品含量为3.486 μg/g。吴春敏[4]采用甲醇—乙腈提取—OASISHLB3cc固相萃取小柱分离的方法测定6月采集的福建泰宁的2份样品，1份没有检测到雷公藤甲素，1份含量为9.9 μg/g。本研究采用3种方法提取分离叶中雷公藤甲素，HPLC法测定含量，旨在寻找到比较好的样品处理方法，以便更准确地测定叶中雷公藤甲素的含量。

1　材料与仪器

1.1药材来源

雷公藤叶是野生于江西萍乡、湖南岳阳、湖北通城、福建泰宁、浙江丽水5省，移栽至黄石1年，再采集枝条扦插成活2年的雷公藤的叶，消除了种植年限对雷公藤甲素含量的影响，分别于2015年7月、11月在湖北理工学院医学院雷公藤种植基地采集，将叶平铺于桌面晾干，粉碎备用。

1.2仪器与试剂

STI 501型HPLC色谱系统(赛智科技)，Kromastar C18柱(250 mm×4.6 mm；5 μm)；QT08超声清洗器(天津市瑞普电子仪器公司)；RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；雷公藤甲素(批号：Y2556Y17052，纯度>98%，上海源叶生物科技有限公司)；甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司)，色谱用水为双蒸水；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳等均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件

流动相为甲醇-水(45∶55)；流速：0.8 mL/min；检测波长：218 nm；常温柱；进样量20 μL[5]。

2.2标准曲线的制备

精密称取雷公藤甲素标准品5 mg，加甲醇定容至10 mL，得标准品贮备液。精密吸取贮备液，用甲醇分别稀释成2,5,10,20,50 μg/mL标准溶液。 进样检测，以浓度C对峰面积A求出线性回归方程为：A=74796C-141853，r=0.9992，线性范围为2～50 μg/mL。

2.3样品处理及制备

2.3.1方法1

取11月采湖北通城雷公藤叶5 g，精密称定，置250 mL圆底烧瓶中，加石油醚100 mL，微沸回流2 h，滤除石油醚，挥干药渣。加70%甲醇溶液120 mL，回流2 h，分离得到甲醇提取液，重复提取1次，合并得到的甲醇提取溶液，减压回收甲醇；剩余水液用四氯化碳层50 mL分2次萃取，弃四氯化碳；水液用氯仿75 mL分3次萃取，合并氯仿萃取液，减压回收氯仿至干，甲醇9 mL分2次加入溶解，转移至10 mL容量瓶中定容，得样品溶液Ⅰ[6-7]。

2.3.2方法2

取11月采湖北通城雷公藤叶的粉末5 g，精密称定，置250 mL圆底烧瓶中，加入100 mL乙酸乙酯，微沸回流提取2 h，过滤，收集滤液，残渣加乙酸乙酯重提1次，过滤，合并滤液，减压浓缩至小体积，过中性氧化铝柱(10 g中性氧化铝、柱内径1.0 cm)，用100 mL乙酸乙酯洗脱，收集全部洗脱液，浓缩，甲醇溶解并定容至10 mL转移至容量瓶，得样品溶液Ⅱ[5]。

2.3.3方法3

取11月采湖北通城雷公藤叶的粉末5 g，精密称定，置250 mL圆底烧瓶中，加入100 mL石油醚，微沸回流2 h，滤除石油醚，挥干药渣。加100 mL乙酸乙酯，按“2.3.2”项下方法提取分离，得样品溶液Ⅲ。

2.4样品中雷公藤甲素含量测定

分别将不同方法处理所得到的样品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ过0.45 μm微孔滤膜，取20 μL进样，测得峰面积A，代入回归方程计算含量，3种样品处理方法所测雷公藤甲素含量见表1，不同方法制备的样品溶液色谱图见图1。

表1　3种样品处理方法所测雷公藤甲素含量(n=3)

图1　HPLC色图谱

2.55省雷公藤叶中雷公藤甲素含量测定

分别取种源于江西萍乡、湖南岳阳、湖北通城、福建泰宁、浙江丽水5省，于黄石野生驯化扦插的雷公藤叶各2 g(7月采集)，精密称定，按照“2.3.1”项下方法制备样品溶液10 mL，过0.45 μm微孔滤膜，取20 μL进样，测得峰面积A，代入回归方程计算含量，5省雷公藤叶中雷公藤甲素含量见表2。

表2　5省雷公藤叶中雷公藤甲素含量(n=3)

2.6加样回收试验

精密称取已知含量的11月采湖北通城雷公藤叶粉末2.0 g，共6份，分别精密加入雷公藤甲素对照品溶液(0.50 mg/mL)0.08，0.1，0.12 mL各2份，按方法1样品溶液制备方法制备，依法测定。6次平均回收率为95.4%，RSD为2.55%，加样回收试验结果见表3。

表3　加样回收试验结果

3　讨论

3.13种样品处理方法的设定

李汉保[6]利用溶剂萃取分离的方法得到“雷公藤叶中雷公藤甲素含量高于根3倍”的结论；程敬丽[7]等用溶剂萃取分离方法得到雷公藤甲素浓度高达1.83%的氯仿溶液，并且对石油醚、四氯化碳萃取液进行了检测，基本没有检测到雷公藤二萜内酯类化合物。故本试验选择了石油醚除色素—甲醇水提—氯仿萃取作为方法1；方法2中乙酸乙酯提取—氧化铝柱分离与湖北省中药材质量标准中雷公藤根的含量测定方法相似；由于叶中含大量的色素，故方法3在雷公藤根的检测方法基础上增加石油醚除色素步骤。

3.23种样品处理方法的结果比较

从样品溶液的颜色看，方法1得到淡黄色溶液，方法2得到绿色溶液，方法3得到淡绿色溶液，说明色谱柱并不能很好地除去色素类杂质。从色谱图上看，方法1中雷公藤甲素的保留时间基本与标准品一致(19.732 min)，且峰形对称，分离效果较好；方法2和方法3中雷公藤甲素峰不明显，只在20.731 min附近有一峰形宽、对称性不佳的峰。表1中数据显示，方法1所测雷公藤甲素含量高出方法2、方法3约4倍以上。方法1的石油醚提取、四氯化碳萃取都可以不同程度地去除色素、脂溶性杂质，氯仿萃取可以富集雷公藤甲素。方法2、方法3用中性氧化铝柱除杂质，分离雷公藤甲素，如果雷公藤叶取样量少，则雷公藤甲素容易因洗脱不完全而损失，使得测定结果出现负误差。

3.3与文献结果比较

表2中数据显示，同是7月份采集的福建泰宁、江西萍乡、浙江丽水野生驯化扦插的雷公藤叶，用方法1处理样品时，测得雷公藤甲素含量高出以往的文献报道[1-2]，只有湖北通城、湖南岳阳2个种源的雷公藤叶没有检测到雷公藤甲素。故笔者认为用石油醚除色素—甲醇水提取—氯仿萃取的方法处理样品，可以更准确地测定雷公藤叶中雷公藤甲素的含量。表2中数据同时也说明雷公藤能适应长江流域的气候，在鄂东南也能正常生长，但不同种源雷公藤叶中雷公藤甲素含量存在明显差异，符合文献报道[8]。

[1]王均琴，李国春，周学平，等.雷公藤提取物治疗类风湿关节炎的Meta分析[J].现代中西医结合杂志，2014,23(10):1032-1035.

[2]徐佳，伍春莲.雷公藤红素诱导非小细胞肺癌H1299细胞凋亡及其机制研究[J].中药材，2015,38(9)：1925-1928.

[3] 张敏.不同产地雷公藤根、叶的主要活性成分研究[D].福州：福建农林大学，2012.

[4]吴春敏.雷公藤化学成分与多组分含量测定研究[D].上海：第二军医大学，2010.

[5]湖北省食品药品监督管理局.湖北省中药材质量标准[S].武汉：湖北科学技术出版社，2009：148-149.

[6]李汉保，王玉玺，王曙东，等.雷公藤地上部分资源利用初探[J].中药材，1990(4)：16-17.

[7]程敬丽，朱烈，朱国念，等.雷公藤甲素的提取工艺[J].农药，2005，44(7)：316-318.

[8]斯金平，阮秀春，郭宝林.雷公藤和昆明山海棠形态变异的研究[J].浙江林业科技，2005,25(1)：2-4.

(责任编辑吴鸿霞)

Effects of Sample Preparation Methods on Determination Results of Triptolide in Tripterygium Wilfordii Leaf

Zheng Deshan,Wang Sanya,Wang Wenqiang,Den Qi,Yu Xin*

(School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003)

Objective:to explore the effects of sample preparation methods on the determination results of triptolide in Tripterygium Wilfordii leaves by the high performance liquid chromatography (HPLC).Methods:Petroleum ether impurity,70% methanol water provided-chloroform extraction;ethyl acetate extraction-alumina column separation;and petroleum ether impurity,ethyl acetate extract-alumina column,the three methods were used to prepare for the test solution,HPLC was used to detect the content of triptolide. Results:With the method of petroleum ether impurity,70% methanol water provided-chloroform extraction preparation for the test solution, the peak retention time was 19.732 min,retention time was basical the same with standard,content is four times higher than the two other preparation methods for the solution.Conclusion:The method of petroleum ether impurity,70% methanol water provided-chloroform extraction is suggested to be used in the quality standard of Tripterygium Wilfordii leaves.

Tripterygium wilfordii leaves;sample preparation;HPLC;chromatogram

2016-03-16

湖北高校省级大学生创新训练计划项目(项目编号：201410920012；201510920008)。

郑德杉，本科生。

喻昕，教授，博士，研究方向：药物分析及生物制药技术。

10.3969/j.issn.2095-4565.2016.04.014

R284.2

A

2095-4565(2016)04-0058-04