烤烟中直链-支链淀粉含量测定方法优化

罗 丹，全学军*，吴 俊，戴 亚，马扩彦

（1.重庆理工大学化学化工学院，重庆 400054；2.重庆中烟工业有限责任公司，重庆 400062）

烤烟中直链-支链淀粉含量测定方法优化

罗 丹1，全学军1*，吴 俊1，戴 亚2，马扩彦2

（1.重庆理工大学化学化工学院，重庆 400054；2.重庆中烟工业有限责任公司，重庆 400062）

为了建立烤烟中直链-支链淀粉的快速高效测定方法，以云烟85为原料，考察了高氯酸浓度、超声时间、超声功率和液固比4个因素对高氯酸超声提取-碘显色-双波长法测定烤烟中淀粉含量的影响。采用响应面Box-Benhnken实验设计原理及响应面分析方法优化了淀粉提取测定工艺。结果表明，烤烟中淀粉提取测定最佳工艺为：高氯酸质量浓度为 49.00%，超声功率为400 W，超声时间为8.50 min，液固比为27 mL/g。在此条件下，加标回收率直链淀粉为104.45%～107.48%，支链淀粉为96.42%～100.51%，相对标准偏差RSD（n=3）＜3.5%。说明Box-Behnken 设计结合响应面分析法优化所得的淀粉测定方法具有较好的精密度及准确度，适合于烤烟淀粉含量测定。

烟草；淀粉；超声提取；响应面法

淀粉是烟草中重要的碳水化合物，广泛存在于烟草的茎叶中。新鲜烟叶经过调制，大部分淀粉降解为还原糖，但处理后的烟叶仍残留一定量的淀粉。一些相关研究证明，烟叶中含有较高的淀粉将会影响燃吸速度且产生有害成分，对烟草的色、香、味产生不良影响［1-2］。目前，我国烤烟中淀粉含量约为4%～6%，而国外优质烤烟淀粉含量仅为1%～2%［3］。因此，进一步研究快速准确测定烟草淀粉的方法，对我国烟草业的发展具有重要意义。

超声提取在烟草精油、多糖、维生素E以及淀粉等方面得到了应用［4-7］。烟草中淀粉含量测定方法有：碘显色法、差示扫描量热仪法（DSC），高效空间排阻色谱法（HPSEC）和近红外光谱法（NIR）等［8-12］。其中碘显色法因为操作简单、分析快捷而被广泛应用。因此，本研究将高氯酸超声提取淀粉工艺与双波长法测定淀粉工艺相结合，建立高效、快速的淀粉检测方法，为进一步了解直链淀粉与支链淀粉理化特性对烟草品质的影响，以及烤烟中淀粉的降解与烤烟品质的关系提供技术支持。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

云烟85烤烟C3F（2012年，四川凉山州西昌市）；直链淀粉和支链淀粉标准样品（美国Sigma公司）；无水乙醇、氯化钠、高氯酸、氢氧化钠、碘、碘化钾（AR，成都市科龙化工试剂厂）。

电子分析天平（感量：0.0001 g，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；KQ-400KDE超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；砂芯过滤装置（深圳市瑞鑫达化玻仪器有限公司）；pH-3S精密酸度计（南京桑力电子厂）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2方法

实验流程：烟草粉粹→过筛（40-100目）→除杂（饱和NaCl-乙醇溶液）→过滤（取滤渣）→提取（高氯酸溶液）→过滤（取滤液）→显色反应（I2/KI溶液）→测吸光度。最后根据对应波长所测定吸光度，计算支链淀粉和直链淀粉的含量。

1.2.1烟草中淀粉含量的计算公式

式中：C为测量液淀粉浓度/（g·mL-1）；V为测量液体积/mL；N为稀释倍数；W为原料重量。

1.2.2标准曲线绘制 按照王文超等［13］文献中标准曲线绘制方法，以从Sigma公司购买的直链淀粉和支链淀粉为标准品，采用碘显色-双波长法测定，绘制标准曲线。根据直链淀粉和支链淀粉的吸收光谱，实验选择测定波长为510、550、590、702 nm。以双波长吸光度差值为纵坐标Y，淀粉溶液质量浓度X/（μg·mL-1）为横坐标，得直链淀粉回归方程为：Y1=0.00822X1+0.01029，R2=0.9969，在5～30 mg/L范围内线性良好；支链淀粉回归方程为：Y2=0.00293X2+0.00412，R2=0.9975，在40～90 mg/L范围内线性良好。

1.2.3单因素试验 超声时间对淀粉含量测定的影响：称取烟末0.6000 g，高氯酸溶液质量比为45%，超声功率280 W，超声时间：1、2、4、6、8、10 min。

超声功率对淀粉含量测定的影响：称取烟末0.6000 g，高氯酸溶液质量比为45%，超声时间8 min，超声功率：160、240、320、360、400 W。

不同液固比对淀粉含量测定的影响：高氯酸溶液质量比为45%，超声时间8 min，超声功率280 W，分别称取烟末：0.400、0.500、0.600、0.800、1.000、1.2000 g，对应液固比为：37.5、25、18.75、15.00、12.5 0、10.00 mL/g。

不同高氯酸浓度对淀粉含量测定的影响：称取烟末0.6000 g，超声时间8 min，超声功率280 W，高氯酸质量比分别为：30%、35%、40%、45%、50%。

2　结　果

2.1单因素实验

超声时间、超声功率、液固比和高氯酸质量浓度单因素对淀粉含量测定的影响，如图1所示。淀粉含量的测定结果随着超声时间和超声功率的增加都呈现先增大后不变的趋势。在液固比影响因素中，液固比在10～12.5 mL/g范围内时，直链淀粉的含量高于支链淀粉的含量，液固比在12.5 mL/g之后，直链淀粉含量的测定结果增长趋势趋于平缓，而支链淀粉含量测定结果持续增长，液固比大于25 mL/g后支链淀粉含量略有下降趋势。在不同高氯酸质量浓度影响因素中，高氯酸质量浓度较低时，淀粉含量的测定都较低，其中直链淀粉含量高于支链淀粉含量，高氯酸质量浓度达40%后淀粉含量测定基本保持不变。

图1　超声时间、超声功率、液固比和高氯酸质量分数对淀粉测定量的影响Fig.1 Influences of ultrasonic treatment time， ultrasonic power， liquid-solid ratio and perchloric acid mass fraction on starch determination

2.2超声提取工艺的优化

2.2.1响应面试验设计 在单因素试验的基础上，根据响应面Box-Behnken设计原理，设计以高氯酸浓度、超声时间、超声功率和液固比为影响因子，以直链淀粉和支链淀粉含量测定值为响应值，采用4因子2水平的响应面分析法，得到二次回归方程，并找出最佳工艺参数［14-15］。试验设计如表1所示。

表1　实验因素与水平Table 1 Levels of factors chosen for the trials

2.2.2响应面试验结果 响应面的试验结果如表2所示，共29个试验点，其中3、9、16、19和21号是中心试验，也即是区域的中心点，试验重复五次，用于估计试验误差。其余24个是析因试验。

应用Design Expert进行回归拟合分析，可得到提取条件与直链淀粉和支链淀粉含量测定值之间的二次多项式模型为：

（1）直链淀粉含量测定结果分析

Y1=-9.593+0.247A+0.018B+0.040C+0.333D-2.42×10-5AB+1.33×10-5AC-1.58×10-3AD-8.75×10-6BC-3.83×10-4BD-6.33×10-4CD-2.32×10-3A2-1.79×10-5B2-5.78×10-4C2-6.02×10-3D2。式中A、B、C、D分别为高氯酸质量比、超声功率、液固比和超声提取时间编码值。对回归方程方差分析和显著性检验（表3）表明，该回归模型F=59.52，P＜0.0001，具有高度显著性。失拟项F=5.03，P=0.0666＞0.05，失拟性不显著，R2=0.9835，RAdj2=0.9670，说明方程对实验拟合性较好。因此，上述回归方程模拟性好，能描述实验中各因素与影响值之间的关系。从表3可以得出，各因素对直链淀粉的提取影响都极显著，其中各因子对烟草中直链淀粉含量测定的影响依次为高氯酸质量比（A）＞超声提取时间（D）＞液固比（C）＞超声功率（B）。

表2　响应面实验设计与结果Table 2 Design and experimental results of RSM

表3　直链淀粉回归方程系数显著性检验表Table 3 Significance for regression equation coefficients of amylose

（2）支链淀粉含量测定结果分析

Y2=-24.849+0.745A+0.045B-0.171C-0.032D-1.11×10-4AB+5.23×10-3AC-2.11×10-4AD+3.31×10-4BC+7.77×10-4BD+9.16×10-5CD-7.68×10-3A2-6.89×10-5B2-2.63×10-3C2-0.012D2。对回归方程方差分析和显著性检验（表4）表明，该回归模型F=45.38，P＜0.0001，具有高度显著性。失拟项 F=3.08，P=0.1449＞0.05，失拟性不显著，R2=0.9784，RAdj2=0.9569，表明支链淀粉含量测定的模拟方程也对实验有较好的拟合。从表4可知，高氯酸质量比、超声提取时间和液固比3个因子对支链淀粉含量测定的影响极显著，超声功率条件对支链淀粉含量测定的影响显著。其中各因子对烟草中支链淀粉含量测定的影响依次为高氯酸质量比（A）＞液固比（C）＞超声提取时间（D）＞超声功率（B）。

2.2.3模型结果验证 运用Design Expert 8.0进一步分析看出，云烟 85超声提取淀粉提取最佳工艺条件为：高氯酸质量浓度为 49.35%，超声功率为392.86 W，液固比为27.30 mL/g，超声时间为8.54 min，直链淀粉理论测定含量为1.68%，支链淀粉的理论测定含量为3.47%。为验证模型的可靠性，按照软件得出的最优条件，选高氯酸质量浓度为49.00%，超声功率为400 W，液固比为27.00 mL/g，超声时间为8.50 min进行试验验证，实测得云烟853次平均值为直链淀粉含量为1.55%，支链淀粉含量为3.57%，与理论值相比直链淀粉相对误差为0.12%，支链淀粉相对误差为0.10%。这表明该模型可靠性较高。

表4　支链淀粉回归方程系数显著性检验表Table 4 Significance for regression equation coefficients of amylopectin

2.3方法回收率

对直链和支链淀粉测定方法回收率进行试验验证，结果如表5所示，直链淀粉回收率为104.45%～107.48%，支链淀粉为 96.42%～100.51%。这表明高氯酸超声提取-双波长分光光度计法在烟草淀粉提取及直链和支链淀粉测定有较高准确度。

表5　方法回收率实验Table 5 The recovery experiment

2.4样品测定

采用本试验方法优化所得条件对云烟85、中烟100和云烟87等5种不同烤烟样品淀粉含量进行测定。结果如表6所示，不同品种烟草中其直链和支链淀粉含量不同，支链淀粉/直链淀粉的比值变化范围为1.4/1～3.1/1。且试验中直链和支链淀粉相对标准偏差（RSD）都小于5%，表明该试验方法具有较好的重复性和精密度。

表6　不同烤烟中淀粉含量的测定Table 6 Determination of starch in different types of tobacco

3　讨　论

采用高氯酸超声辅助提取烟叶中存在淀粉，有效提高了淀粉的提取效率［16］。超声提取过程中淀粉含量测定结果随着超声时间和超声功率的增加而增加，主要因为超声波持续进行机械振动，有利于烟末中的淀粉游离出来，且超声波的空化效应强化了淀粉的提取分离，随着超声功率的增加，超声波产生的空化效应越强烈，对细胞的破壁效果越明显，从而增加了淀粉的溶出率［17-18］。进行响应面优化得出各因子对烟草中直链淀粉含量测定的影响依次为：高氯酸质量比＞超声提取时间＞液固比＞超声功率；对支链淀粉含量测定的影响依次为：高氯酸质量比＞液固比＞超声提取时间＞超声功率。其中高氯酸浓度对两者含量测定影响最大，液固比和超声功率两个因素对支链淀粉和直链淀粉含量测定的影响不同，这主要因为烟草中直链和支链淀粉的含量和结构存在较大差异。此外，本试验采用碘显色双波长法分别测定直链和支链淀粉含量，通过对其回收率和重复性的验证，表明了该方法具有较高的准确性和可行性，为烟草行业中淀粉含量的测定提供了实际应用价值。

4　结　论

烟草中淀粉提取的最佳工艺为高氯酸质量浓度为49.00%，超声功率为400 W，液固比为27.00 mL/g，超声时间为8.50 min，在此条件下测得云烟85中直链淀粉含量为 1.55%，支链淀粉含量为3.57%。且该方法直链淀粉加标回收率 104.45%～107.48%，支链淀粉加标回收率 96.42%～100.51%，多次实验RSD为1.023%～3.176%。表明了本研究采用超声提取-双波长法测定烤烟中淀粉含量有较高的准确性，为烟草中直链淀粉和支链淀粉的快速测定提供了技术支撑。

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Optimization of the Determination Method of Amylose and Amylopectin in Tobacco

LUO Dan1， QUAN Xuejun1*， WU Jun1， DAI Ya2， MA Kuoyan2
（1. School of Chemistry and Chemical Engineering， Chongqing University of Technology， Chongqing 400054， China； 2. China Tobacco Chongqing Industrial Co.， Ltd.， Chongqing 400062， China）

In order to establish a highly effective determination method of starch in flue-cured tobacco， the determination method of tobacco starch using ultrasonic extraction and iodine colorimetry-dual wavelength spectrophotometry was optimized using Yunyan 85 as the raw material. The effects of ultrasonic time， ultrasonic power， perchloric acid concentration and liquid-solid ratio on the ultrasound-assisted extraction of amylose and amylopectin in tobacco were investigated. The extraction process was optimized using the response surface Box-Benhnken experimental design principles and the response surface methodology. The results showed that the optimal extraction conditions were that with the perchloric acid mass concentration of 49.0%， the ultrasonic power of 400 W， the ultrasonic time of 8.50 min， and the liquid-solid ratio of 27 mL/g. At the optimized conditions， the recovery of amylose was from 104.45% to 107.48%， recovery of amylopectin was from 96.42% to 100.51%， and the RSD （n=3） was less than 3.5%. This suggested that the optimized determination method of starch used by the Box-behnken design and response surface analysis have good precision and accuracy and are suitable for the detection of starch in flue-cured tobacco.

tobacco； starch； ultrasonic extraction； response surface

TS41+1

1007-5119（2016）04-0074-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.013

重庆中烟工业有限责任公司科技项目“烟草中淀粉的存在形态及其分析方法研究”（hx201314）

罗 丹（1989-），女，硕士研究生，研究方向：材料化学工程。E-mail：cqrodin@163.com。*通信作者，E-mail：engjunq@cqut.edu.cn

2015-12-30

2016-06-02