大孔树脂分离纯化西洋参叶总皂苷的工艺研究△

郭婷婷，王兆华，张大军

(1.长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021； 2.吉林省中医药科学院，吉林 长春 130012)

大孔树脂分离纯化西洋参叶总皂苷的工艺研究△

郭婷婷1，王兆华2*，张大军2

(1.长春中医药大学附属医院，吉林 长春130021；2.吉林省中医药科学院，吉林 长春130012)

目的：探索以D101型大孔吸附树脂分离纯化西洋参叶总皂苷的工艺条件及参数。方法：以总皂苷及人参皂苷Rb3的吸附率和解吸附率为指标，对大孔树脂分离纯化西洋参叶总皂苷的工艺条件进行考察，并对其吸附动力学曲线和动态解析曲线进行探索。结果：药材与湿树脂量比为3∶10，上柱流速为1.5mL·min-1，重复上样两次，分别用3倍体积的水、3倍体积70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，减压，浓缩，干燥，即得总皂苷提取物。提取物中总皂苷含量>75%，人参皂苷Rb3含量>10%，总皂苷提取物得率约为14%。结论：该工艺简便，重复性好，可用于西洋参叶中总皂苷的提取纯化。

西洋参叶；大孔吸附树脂；总皂苷；人参皂苷Rb3；工艺参数

西洋参PanaxquinquefoliusL.为五加科人参属植物，原产于美国北部到加拿大南部一带，北京、陕西、吉林等地已引种栽培成功[1]。由于西洋参叶所含的主要活性物质—人参皂苷在种类上与主根基本一致，而在含量上明显高于主根等其他药用部位[2-3]，因而具有较高的开发利用价值。D101型大孔吸附树脂分离纯化总皂苷是目前国内外常用的方法[4]，这种方法操作简单、树脂可反复利用、成本低、安全无毒。本实验系统考察了西洋参叶总皂苷的工艺参数，包括吸附量、吸附流速、脱附性能、药液浓度等，为西洋参叶总皂苷提取物的制备工艺提供实验基础。

1 仪器和试药

UV-2800紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪、SPD-10A紫外检测器(日本岛津公司)；KQ-250型超声波处理器(天津奥特赛恩斯仪器公司)；AE163电子天平(瑞士梅特勒公司)。

人参皂苷Rb3对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111686-2010002，供含量测定用)；D101大孔吸附树脂(安徽三星树脂科技有限公司，药用级)；西洋参叶购自靖宇参园；甲醇为色谱纯；乙醇、硫酸、冰醋酸、香草醛等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1总皂苷含量测定

2.1.1标准曲线的制备 取人参皂苷Rb3对照品，加甲醇制成质量浓度为0.964mg·mL-1的溶液，摇匀。分别精密吸取上述溶液25、50、100、150、200、250μL，分别置于具塞试管中，蒸干，加入1%香草醛高氯酸试液0.5mL，置60℃水浴上加热15min，立即取出，用冰水冷却2min，加入77%硫酸溶液5mL，摇匀，以相应试剂作为空白。于540nm波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，线性范围为24.10～241.0μg。

2.1.2供试品溶液的制备与测定 取西洋参叶总皂苷提取物0.15g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10mL，蒸干，残渣加水10mL使溶解，以水饱和正丁醇提取3次，每次20mL，合并正丁醇提取液，以正丁醇饱合水溶液洗涤2次，每次15mL，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至10mL量瓶内，以甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液[5]。精密吸取供试品溶液40μL，蒸干，照标准曲线制备项下方法自“加入1%香草醛高氯酸试液0.5mL”起，依法测量吸收度，计算样品的含量。

2.1.3检测波长的选择 取对照品溶液和供试品溶液，显色后在480～620nm波长范围内扫描，最终确定检测波长为540nm。光谱扫描曲线见图1。

注：A.人参皂苷Rb3对照品；B.西洋参叶供试品。图1 对照品和供试品光谱扫描曲线

2.2人参皂苷Rb3含量测定

2.2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-水(32︰68)为流动相；检测波长为203 nm；柱温为室温，理论板数按人参皂苷Rb3计算应不低于2500。

2.2.2 对照品溶液的制备 取人参皂苷Rb3对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为 0.5 mg·mL-1的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备与测定 分别精密吸取2.1.2项下供试品溶液及上述对照品溶液各10 μL，按2.2.1项下的色谱条件进行测定，计算含量，液相色谱图见图2。

注：A.对照品；B供试品；1.人参皂苷Rb3。图2 对照品和供试品液相色谱图

2.3工艺条件及参数的优化

2.3.1大孔树脂预处理 新的D101大孔树脂在使用前，用5倍量95%乙醇浸泡24h，用水洗至无醇味，继用5%HCl浸泡2～3h，用水冲洗至中性，再用5%NaOH浸泡2～3h，用水冲洗至中性，备用。

2.3.2上柱溶液的制备 称取西洋参叶适量，用12倍量水煎煮2次，每次1h，滤过，合并滤液，定容至一定体积，即得上柱溶液(每mL含0.04g生药)，备用。经测定总皂苷含量为4.640mg·mL-1；人参皂苷Rb3含量为1.073mg·mL-1。

2.3.3大孔吸附树脂对西洋参叶总皂苷静态饱和吸附量与解吸率的测定 静态饱和吸附量的测定[7]：准确称取已处理好的D101大孔吸附树脂15.0g，置于250mL锥形瓶中，准确加入西洋参叶上柱溶液200mL，在100r·min-1的条件下振荡24h，使之充分吸附，滤过，取续滤液10mL，蒸干，照2.1.2项下方法自“残渣加水10mL使溶解”起，依法制得供试品溶液，并测定吸附剩余液中总皂苷及人参皂苷Rb3含量，计算D101大孔树脂在室温条件下对西洋参叶茎叶总皂苷及人参皂苷Rb3的饱和吸附量。

吸附量=[(吸附前浓度-吸附后浓度)×溶液体积]/树脂质量，测定结果见表1。

静态解吸实验：经过24h静态吸附的树脂淋净液体，准确加入200mL80%的乙醇，室温下连续振荡12h，使皂苷充分解吸附，滤过，取续滤液，测定总皂苷及人参皂苷Rb3含量，计算解吸率。

解吸率(%)=[(解吸后溶液浓度×解吸后溶液体积)/(吸附前溶液浓度×吸附液体积-吸附后溶液浓度×吸附液体积)]×100%，测定结果见表1。

表1 静态饱和吸附量与解吸率的测定(n=3)

2.3.4 大孔吸附树脂对西洋参叶总皂苷动态饱和吸附量与解吸率的测定 动态饱和吸附量的测定：取西洋参叶上柱溶液，缓慢通过装有D101大孔树脂15 g的柱，控制流速为1.5 mL·min-1，每10.0 mL为1个流份，收集20份，蒸干，照2.1.2项下方法自“残渣加水10 mL使溶解”起，依法制得供试品溶液，并测定各流份中总皂苷及人参皂苷Rb3的含量。以流出液中总皂苷的含量为纵坐标，流出液收集管数为横坐标绘制动态吸附流出曲线，吸附流出曲线见图3。

图3 西洋参叶提取溶液动态吸附流出曲线

结果表明，从第11流份开始，流出液颜色逐渐加深，皂苷出现逐渐泄漏现象，第16份时洗出液中总皂苷含量已达原药液含量的50%，并一直持续至20份，但未出现洗出液中总皂苷含量与上柱溶液相当的流份。

动态解吸实验：动态吸附饱和的树脂，用水洗至近无色，再以80% 乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱液，并定容至100 mL，精密吸取5 mL，蒸干，照2.1.2项下方法自“残渣加水10 mL使溶解”起，依法制得供试品溶液，并测定总皂苷及人参皂苷Rb3含量，计算D101大孔树脂在室温条件下对西洋参叶茎叶总皂苷及人参皂苷Rb3的饱和吸附量，测定结果见表2。

表2 动态饱和吸附量和解吸率的测定(n=3)

结果提示，上柱溶液反复多次通过D101吸附树脂，可促使吸附树脂接近饱合。为避免生产过程中造成总皂苷的泄漏损失，结合静态吸附实验结果，以树脂吸附量的80%上样，即每g大孔树脂总皂苷的上样量不得超过34 mg；人参皂苷Rb3的上样量不超过6.5 mg，即10 kg树脂上样量不超过3 kg西洋参叶药材。

2.3.5 洗脱溶媒的选择 采用乙醇-水系统为洗脱液，取经过24 h静态吸附的树脂，先用3倍柱体积的水洗脱，再依次用4倍柱体积的10%、20%、30%、50%、70%、80%的乙醇连续洗脱，各洗脱液分别定容至100 mL，取各洗脱液5～20 mL，制备供试品溶液，照含量测定方法分别测定总皂苷和人参皂苷Rb3的含量，计算洗脱率，洗脱曲线见图4。

图4 不同浓度乙醇洗脱曲线

由图4可知，用70%乙醇溶液洗脱总皂苷及人参皂苷Rb3，洗脱量均最高，且累计洗脱率均在95%以上，故选择70%乙醇溶液作为洗脱溶媒。

2.3.6 洗脱溶媒用量 取经过24 h静态吸附的树脂，先用3倍柱体积的水洗柱除，去水溶性杂质，然后用70%乙醇溶液洗脱，分段收集，定容，测定洗脱液中总皂苷的含量及人参皂苷Rb3含量，以洗脱液中人参皂苷的含量为纵坐标，收集管数为横坐标绘制动态脱附曲线。计算洗脱率，确定洗脱溶媒用量。洗脱溶溶媒用量曲线见图5。

图5 洗脱溶媒用量曲线

由图5可知，三倍体积70%乙醇可使总皂苷及人参皂苷Rb3的洗脱率在90%以上，由此确定解吸洗脱溶液的用量为柱体积的3倍。

2.3.6 上柱溶液浓度和上样流速试验 因素水平：以上柱液浓度(A)、吸附流速(B)为因素，总皂苷含量及提取物得率为考察指标进行全面试验。因素水平见表3。

表3 上柱溶液浓度和上样流速试验水平表(n=3)

全面试验：称取西洋参叶60 g，平行9份，用12倍量水煎煮2次，每次1 h，滤过，合并滤液，浓缩并定容至一定体积，制得不同浓度的上柱溶液。按表3条件，通过吸附树脂(装量200 g)柱，依次分别用3倍体积的水、3倍体积70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，减压、浓缩、干燥，即得总皂苷提取物。采用2.1项下方法，测定总皂苷含量，结果见表4。

表4 上柱溶液浓度和上样流速的试验结果(n=9)

从表4可以看出，随着上样液浓度及吸附流速的增加，干膏得量及干膏中总皂苷含量有所变化；为保证提取效率及提取效果，选用上柱溶液浓度为0.4 g·mL-1，上样流速为1.5 mL·min-1。

2.3.7 重复验证试验 称取西洋参叶3 kg，加12倍量水煎煮2次，每次1 h，滤过，滤液浓缩至6000 mL，通过装有10 kg预处理好的D101树脂柱，Φ200 mm×600 mm，按1.5 mL·min-1流速上样，将流出液重复通过树脂柱，先用蒸馏水(3 BV)洗涤，再用70%的乙醇(3 BV)洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，减压干燥，测定干膏中总皂苷和人参皂苷Rb3的含量。结果见表5。

表5 重复验证结果(n=3)

3 讨论

验证试验表明，西洋参叶加12倍量煎煮提取2次，每次1h，浓缩至每ML含0.5g生药，以D101大孔树脂进行吸附，使用浓度70%的乙醇进行洗脱，即可获得高收率、高含量的皂苷提取物，总皂苷含量大于75%，该方法操作简便且易于实现工业化。

本研究中，用分光光度法与HPLC法结合的双指标测定方法来考察工艺条件和参数，而在考察上柱溶液浓度和上样流速时仅采用了分光光度法，为的是缩短分析时间，同时达到含量测定结果准确。

在试验中表明，西洋参叶90℃温浸2h，与煎煮提取1.0h的效果相当。

弃去水及30%乙醇洗脱液，收集70%洗脱液，所得提取物中总皂苷含量没有明显变化，而人参皂苷Rb3含量明显提高。

将上柱溶液重复通过树脂柱，可提高干膏得率及提取物中总皂苷和人参皂苷Rb3的含量，但在动态吸附考察时未找到吸附饱和点，初步分析可能是吸附树脂的吸附性与时间有关，其内在联系有待进一步研究。

[1] 魏晓雨，田义新，赵智灵，等.我国西洋参引种30年后遗传稳定性研究[J].中国中药杂志，2014，39(19)：3723-3726.

[2] 阮征，姜永涛，李国强.西洋参叶中皂苷类成分指纹图谱研究[J].中国现代中药，2011，13(3)：3723-3726.

[3] 辛艳茹，马萍，张英娜.西洋参叶的研究进展[J].时珍国医国药，2001，12(8)：274.

[4] 杨莹莹，张广晶，张舒媛.大孔树脂在中药研究中的应用[J].辽宁中医杂志，2014，41(10)：2193-2195.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010.

[6] 王隶书，李阳，程东岩.HPLC法测定通栓冻干粉针中人参皂苷Rb3的含量[J].中国实验方剂学杂志，2005，11(3)：11-12.

[7] 辛海量，盛佳钰，葛凌弦，等.人参叶提取物的制备工艺研究[J].医药导报，2011，30(1)：79-82.

PurificationofTotalSaponinsofLeavesofPanaxquinquefoliusbyMacroreticularResin

GUOTingting1，WANGZhaohua2*，ZHANGDajun2

(1.TheAffiliatedHospitalToChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130021，China;2.AcademyofChineseMedicalSciencesofJilinProvince,Changchun130012,China)

Objective：The study aims at purification of total saponins of leaves ofPanaxquinquefloiusby D-101macroreticular resin.Methods：Using the adsorption and desorption rates of total saponins and ginsenside Rb3as parameters，the purification technological conditions of total saponins of the leaves ofP.quinquefloiusby macroreticular resin were experimentally investigated.The curves of adsorption kinetics and dynamic adsorption kinetics of macroreticular resin were exploited.Results：The rate of medicinal materials and the wet resin content was3∶10.The flow rate of the macro-reticular resin column was1.5mL·min-1.The experiments were repeated twice.The column was eluted by water of three times volume and ethanol of three times volume.After then ethanol elution was collected.The ethanol elution was concentrated，dried，and then the total saponins extract of the leaves ofP.quinquefloiuswas obtained.The contents of total saponins in extract was more than75%.The contents of ginsenside Rb3was more than10%.The yield of total saponins extract was14%.Conclusion：This method is simple，repeatable，available for extract and purification of total saponins of the leaves ofP.quinquefloius.

Leaves ofPanaxquinquefloius；macroreticular resin；total saponins；ginsenside Rb3；technological conditions and parameters

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.025

2015-05-04)

国家科技重大专项(2013ZX09103002-022)；吉林省科技发展计划专项(20140311014YY)

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王兆华，主任药师，研究方向：中药新药与新制剂；Tel：(0431)86058659，E-mail：wangzhaohua221@163.com