地龙抗呼吸道合胞病毒的有效部位筛选△

张加泽，任莹，王清，候宝山，牛文斐，姜爱雯，周长征*

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.河北北方学院 附属第一医院，河北 张家口 075000)

地龙抗呼吸道合胞病毒的有效部位筛选△

张加泽1，任莹1，王清1，候宝山1，牛文斐1，姜爱雯2，周长征1*

(1.山东中医药大学，山东 济南250355；2.河北北方学院 附属第一医院，河北 张家口075000)

目的：研究地龙不同极性的粗提取物经纯化分离后对呼吸道合胞病毒(RSV)的体外抗病毒活性，从而确定抗病毒的有效部位。方法：预实验依次用乙酸乙酯、95%乙醇水溶液、水作为溶剂提取药物，采用RSV-Hep-2细胞感染模型，初步检测地龙的体外抗RSV活性。依据预实验的结果，分别采用水提醇沉法和醇提水沉法对粗提取物进一步地分离和纯化，将处理后的上清液和沉淀物分别进行体外抗病毒实验。然后根据实验结果将醇提水沉后的沉淀过大孔树脂DM130，分别用25%、50%、75%的乙醇水溶液洗脱，将洗脱液浓缩后做抗病毒实验，在显微镜下观察细胞的病变，用酶标仪测定中性红染色A540值，计算其治疗指数。结果：乙酸乙酯、乙醇、水3种粗提取物中水粗提取物对呼吸道合胞病毒的抑制效果最好，TI=74.21。将粗提取液水提醇沉或醇提水沉后发现醇提水沉的沉淀对呼吸道合胞病毒的抑制效果最好，TI=107.11。将地龙醇提水沉的沉淀过大孔树脂DM130发现75%乙醇2号水溶液冲洗的洗脱液抑制呼吸道合胞病毒的效果最好，TI=63.05.结论：地龙的醇溶性成分对RSV病毒具有明显的抑制作用。

地龙；粗提取物；水提醇沉；醇提水沉；大孔树脂；抗呼吸道合胞病毒

地龙，又称为蚯蚓、歌女、广地龙、曲蟮等，雌雄同体，始载于《神农本草经》，属于环节动物门。地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)、通俗环毛蝴PheretimavulgarisChen、威廉环宅顿Pheretimaguillelmi(Michaelsen)或柿盲环毛蝴PheretimapectiniferaMkhaeken的干燥体。其性寒、味咸，归肝、脾、膀胱经。具有清热定惊、通络、平喘、利尿的功能。用于高热神昏，惊痫抽搐，关节痹痛，肢体麻木，半身不遂，肺热喘咳，水肿尿少[1]。地龙在我国作为药物在临床上使用已经有数千年的历史[2]。目前还没有关于地龙抗呼吸道合胞病毒的报道。本实验采用不同极性的溶剂分别提取地龙，然后采用醇提水沉法、水提醇沉法、大孔树脂吸附法进一步纯化分离，采用RSV-Hep-2体外病毒感染模型研究了地龙对呼吸道合胞病毒的体外抑制作用，为筛选出抗RSV的单体做前期准备。

1 材料与仪器

1.1仪器

TD5M型高速台式离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；超净工作台(上海力申科学仪器有限公司)；酶标仪(Labsystems公司)；荧光倒置显微镜(日本奥林帕斯公司)；高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；隔水式二氧化碳培养箱(美国Forma公司)；微量移液器(法国GILSON公司)；725型超低温冰柜(-80℃，ThermoForma公司)；低温冰柜(-40℃，三洋公司)；CNX-31倒置显微镜(Olympus公司)。

1.2病毒株与细胞株

呼吸道合胞病毒(中国疾病预防控制中心病毒研究所流感病毒研究室)；Hep-2细胞(山东省医学科学院基础医学院研究所微生物室)。

1.3试剂与药品

地龙(购自济南建联中药店)，1640细胞培养液(美国GIBCO产品，含10%牛血清)；1640细胞维持液(美国GIBCO产品，含2%牛血清)；中性红染液；中性红脱色液；乙酸乙酯(分析纯)；工业乙醇；pH值7.4的磷酸盐缓冲液(PBS，含NaCl8g、KCI0.2g、KH2P040.2g、Na2HP042.9g，加三蒸水至1000mL，过滤除菌，分装，置4℃备用)；蒸馏水；MEM培养基(GIBCO公司)；利巴韦林(100mg·mL-1，山东鲁抗医药集团有限公司)。

2方法

2.1粗提取物的制备

水总提取物的制备：将50g地龙加水煎煮提取两次(第一次加10倍水煎煮2h，第二次加8倍水煎煮1.5h)，将粗提液合并后趁热抽滤，减压浓缩至50mL(1g·mL-1)，装入EP管中贴标签备用。

95%乙醇总提取物的制备：将地龙30g用95%的乙醇回流提取两次(第一次加10倍量乙醇回流2h，第二次加8倍量乙醇回流1.5h)，把粗提液合并后趁热抽滤，减压回收乙醇，得浓缩液30mL(1g·mL-1)，装入EP管中贴标签备用。

乙酸乙酯总提取物的制备：地龙20g，用乙酸乙酯回流提取两次(第一次加10倍量乙酸乙酯回流1.5h，第二次加8倍量乙酸乙酯回流1.5h)。将两次粗提液合并后抽滤，减压回收乙酸乙酯得浓缩液20mL(1g·mL-1)，装入EP管中贴标签备用。

2.2水提醇沉法和醇提水沉法纯化

水提醇沉法：将30g地龙加水煎煮两次(10倍水，8倍水，每次2h)，将两次粗提液合并后趁热抽滤，水浴浓缩至1∶1[3]，向浓缩液中缓慢加入95%乙醇水溶液，并快速搅拌，直至含醇量达到70%，然后静置24h[4]，过滤，滤液减压回收乙醇至质量浓度为1g·mL-1，装入EP管中贴标签A备用。滤饼用蒸馏水溶解后水浴浓缩至1g·mL-1[5]，装入EP管中贴标签B备用。

醇提水沉法：将20g地龙用95%乙醇水溶液回流提取两次(8倍量乙醇，每次2h)，合并粗提液后抽滤，减压回收乙醇得浓缩液20mL(1g·mL-1)，向浓缩液中缓缓加入等体积的蒸馏水，并快速搅拌，使含醇量达到50%后静置冷藏24h，过滤，滤液水浴浓缩至1∶1，保存至EP管中贴标签C备用。滤饼用乙醇溶解，水浴浓缩至1g·mL-1，装入EP管中贴标签D备用。

根据实验结果将醇提水沉的沉淀用大孔树脂DM130吸附进一步筛选地龙抗呼吸道合胞病毒的有效部位。

2.3大孔树脂吸附

大孔树脂DM130的预处理：取大孔树脂DM130200g，用95%乙醇水溶液浸泡24h后采用湿法装柱。首先将大孔树脂加入到色谱柱中，并不断敲打色谱柱使大孔树脂紧密均匀，然后用蒸馏水冲洗，直到洗出液没有醇味为止，加入5%HCl水溶液浸泡3h，然后用蒸馏水冲洗，直到洗出液为中性为止。再加入5%NaOH水溶液浸泡3h后用蒸馏水冲洗，直到洗出液为中性为止，密封备用。

上样：将地龙醇提水沉的沉淀用乙醇溶解浓缩后用玻璃棒缓慢上样在上述备用的大孔树脂柱中，然后打开阀门，使药液下降至刚刚没过树脂，待药液吸附0.5h后，依次用25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇水溶液进行洗脱，流速为3BV·h-1，每个浓度梯度洗脱时，每200mL接一瓶，直到流出液没有颜色为止。然后将每个柱体积编号如1水，2水，25%醇1号等。

体外抗病毒实验：把液氮冻存的Hep-2细胞立刻放入37℃的水浴中，不停晃动细胞瓶使其快速融化并悬浮于培养液中，然后将细胞培养瓶放在37℃、5%CO2条件下静置培养，细胞3d后会长成单层，再用0.25%胰酶消化，然后进行1∶2传代，细胞长成单层时用于实验。

将地龙的粗提取物分别用2%1640细胞维持液以2倍比做成共12个稀释度，按稀释度的顺序将粗提取物横向接种于2块96孔板中的单层Hep-2细胞上，每个孔100μL，然后每个孔加入100μL的用2%1640细胞维持液(1∶10)稀释的呼吸道合胞病毒，同时设细胞对照组、病毒对照组及阳性对照组。在37℃、5%CO2条件下培养，并且观察细胞病变效应(CPE)。当病毒对照组CPE达90%以上时，用电子显微镜观察，将96孔板中的培养液倒出，每孔加100μL的中性红染液，放入37℃培养箱反应1h后取出，倒出染液，用缓慢的水流冲洗3～5次，甩干，每个孔加入100μL脱色液，放在37℃恒温箱放置15min，再用酶标仪于540nm处测定吸光度(OD)值[6]。用Reed-Mucnch法分别计算它们的治疗指数TI。

根据预实验的结果，将地龙的水粗提取物加乙醇沉淀，得上清液和沉淀，编号为A、B，将醇粗提取物加水沉淀，得上清液和沉淀，编号为C、D。分别将A、B、C、D重复上述操作过程做体外抗病毒实验。根据第二次的实验结果将地龙醇提水沉后的沉淀D过大孔树脂DM130，将洗脱液做上述体外抗病毒实验。

3 结果

细胞存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(细胞对照组OD值-空白组OD值)×100%[7]，如果存活率>50%，则视为有效。按照Reed-Muench氏法分析以上数据，计算药物半数中毒浓度(TC50)和药物半数有效浓度(EC50)。粗提取物的OD值测定结果见表1。醇提水沉和水提醇沉后的OD值测定结果见表2。过大孔树脂的每个洗脱液的OD值测定结果见表3。

存活率=(病变孔OD值-空白孔OD值)/(细胞对照孔OD值-空白孔OD值)

病变率=1-存活率

细胞比距=(高于50%的病变率-50%)/(高于50%的病变率-低于50%病变率)

细胞存活率大于50%最后一个浓度为药物半数有效浓度(EC50)

细胞存活率大于50%之前的浓度为药物半数中毒浓度(TC50)

EC50=[Antilog(log高于50%存活率药物稀释度的值-比距)]

TC50=[Antilog(log高于50%病变率药物稀释度的值-比距)]

TI=EC50/TC50[8]

表1 地龙粗提取物各浓度的吸光度

表2 地龙水提醇沉和醇提水沉后各浓度的吸光度

表3 过大孔树脂洗脱液各浓度的吸光度

按照Reed和Muench氏法计算表格数据，可以看出水粗提取物的抗病毒效果最好，TI为74.21；醇粗提取物经过加水后的沉淀抗病毒效果最好，TI为125.72；醇提水沉的沉淀过大孔树脂DM130发现2号75%乙醇水溶液冲洗的洗脱液抑制呼吸道合胞病毒的效果最好，TI为63.05。利巴韦林的抑毒指数TI为117.62。

4 讨论

RSV属于副黏病毒科肺炎病毒属，具有使细胞融合的活性[9]。它可以导致婴幼儿急性下呼吸道感染，还可以引起间质性肺炎以及毛细支气管炎等[10]，同时也可引起老年人和免疫缺陷病人肺炎死亡[11]。虽然呼吸道合胞病毒在50年前就备受关注，但是目前仍缺乏对其有效的预防治疗措施。利巴韦林是广谱的对呼吸道合胞病毒有一定疗效的抗病毒药物，但是经过研究发现，经过呼吸道合胞病毒感染的棉鼠模型出现了利巴韦林的抵抗株[12]，因此探索对呼吸道合胞病毒具有抑制作用的中药天然药物具有重大前景。

《神农本草经》记载了地龙具有消炎止痛、平喘、通络等功效，通过用不同极性的溶剂提取，以及醇提水沉、水提醇沉和大孔树脂柱吸附纯化后发现，75%乙醇2号水溶液冲洗的洗脱液具有明显的抗病毒作用，说明其为地龙抗病毒的主要活性部位，为分离出抗病毒的单体做好了前期准备。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部 [S].北京：中国医药科技出版社，2015：122-123.

[2] 陈洪，陆亚琴，刘顺英，等.地龙2号对大鼠肝纤维化TGF-131，MMP-13及TIMP-1mRNA和蛋自表达的影响[J].世界华人消华杂志，2004，12(10)：354-356.

[3] 孙月霞，吴淑娥.初膏浓度对醇沉效果的影响[J].基层中药杂志，2000，14(5)：36.

[4] 陈勇，李页瑞，金胤池，等.中药醇沉工艺及装备研究进展与思考[J].世界科学技术—中医药现代化，2007，9(5)：16-19.

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[7] 张建军，李洪源，王吉锡，等.甘草活性成分抗呼吸道合胞病毒作用[J].中国公共卫生，2007，23(6)：723-724.

[8] 张少华，孟红.翼果苔草提取物体外抗病毒的实验研究[J].山东中医杂志，2010，29(4)：48-49.

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ScreeningforAnti-RespiratorySyncytialVirusActivePartsofGeosaurus

ZHANGJiaze1，RENYing1，WANGQing1，HOUBaoshan1，NIUWenfei1，JIANGAiwen2，ZHOUChangzheng1*

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China；2.Thefirsthospitalaffiliatedtohebeiinstituteofnorth，Zhangjiakou075000，China)

Objective：To study anti-RSV activities of the crude extracts with different polarity after purified and separated from the Geosaurus，determine the effective parts of antivirus further.Methods：Ethyl acetate，95% ethanol and pure water were used as the solvent to extract drugs respectively.Anti-RSV activities in vitro were detected preliminarily by RSV-Hep-2virus-cell infection model of ethanol.Crude extracts were purified and separated further by water extraction ethanol precipitation and ethanol extraction water precipitation methods respectively.Supernatants and sediments were used as the antivirus experimentsinvitro.After the sediments from ethanol extraction water precipitation DM were filtered by130macroporous absorbent resin，the filters were eluted by25%、50%、75% ethanol respectively according to the results.In the end the antivirus experiments were carried out by the concentrated eluent.The cytopathic effect (CPE) was observed under a microscope.Neutral red staining was measured in a microplate reader at540nm to calculate the therapeutic index (TI).Results：Among the three total extracts from Geosaurus by ethyl acetate，95% ethanol and pure water，the pure water total extract was the most effective for Anti RSV(TI=125.72).The filters from sediments from ethanol extraction water precipitation DM were filtered by130macroporous absorbent resin，and it showed that eluent of75% ethanol in number2was the most effective for Anti RSV(TI=63.05).Conclusion：The ingredients of alcohol dissolved have the most significant inhibited effect on respiratory syncytial virus.

Geosaurus；crude extracts；water extraction ethanol precipitation methods；ethanol extraction water precipitation methods；macroporous resin；anti-respiratory syncytial virus (RSV)

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.009

2015-12-30)

山东省中医药抗病毒应用基础与关键技术及产业化课题(XTCX2014C01-04)

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周长征，教授，硕士研究生导师，研究方向：药物新剂型与新技术；E-mail：zcznfj@sina.com